本文關(guān)鍵詞：新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中的作用及其分子機(jī)制

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【摘要】：圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是導(dǎo)致兒童殘疾的最重要的疾病。因此缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)的機(jī)制研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。其發(fā)病機(jī)制主要包括有興奮性氨基酸中毒、氧自由基、鈣超載、免疫炎癥反應(yīng)等。雖然有關(guān)缺血性腦細(xì)胞死亡的興奮性毒性和氧化脅迫以及細(xì)胞凋亡方面的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但HIE的臨床治療效果仍不理想。近年來腦缺氧缺血再灌注導(dǎo)致的炎癥免疫損傷機(jī)制日益受到人們的關(guān)注。由缺氧缺血再灌注誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦組織損傷的主要原因之一。Tim-3 (T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)是一種新型免疫調(diào)節(jié)因子,已被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種免疫細(xì)胞上,在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要得調(diào)節(jié)作用。表達(dá)于Th1細(xì)胞表面的Tim-3與其配體galectin-9一起,可抑制免疫反應(yīng),誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡。Tim-3與巨噬細(xì)胞M1/M2的極化、移植免疫耐受、腫瘤免疫反應(yīng)等多種免疫調(diào)節(jié)過程相關(guān)。Tim-3在免疫炎癥相關(guān)疾病中已顯示出潛在的治療作用,但有關(guān)其在HIBD中作用及機(jī)制的研究尚屬首次。本研究利用動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型,通過正反雙向論證,對(duì)Tim-3在圍產(chǎn)期HIBD中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究。研究發(fā)現(xiàn)：1、缺氧缺血刺激促進(jìn)腦內(nèi)Tim-3表達(dá)顯著升高,并主要集中于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。給予新生小鼠缺氧缺血刺激,通過病理組織學(xué)分析、凋亡檢測(cè)等方法判斷神經(jīng)元損傷程度；利用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學(xué)染色及激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)腦內(nèi)Tim-3的表達(dá)及細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,HIBD組小鼠腦內(nèi)缺血敏感區(qū)Tim-3表達(dá)顯著上調(diào),活化小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)Tim-3的主要來源。2、Tim-3對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制研究。本研究分別利用Tim-3過表達(dá)質(zhì)粒及小干擾RNA在BV2細(xì)胞系上構(gòu)建Tim-3過表達(dá)、敲減、阻斷模型,研究Tim-3對(duì)缺氧缺血再?gòu)?fù)灌介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子及NO功能的影響。研究發(fā)現(xiàn),Tim-3可通過NF-κ B途徑,增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α,IL-1β等促炎因子及iNOS的表達(dá),介導(dǎo)缺氧缺血再灌注后腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。3、特異性阻斷Tim-3的作用可對(duì)HIBD損傷神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用。我們利用Tim-3阻斷性抗體及Tim-3mut小鼠特異性阻斷Tim-3的作用,通過病理組織學(xué)分析、凋亡檢測(cè)等方法判斷神經(jīng)元損傷程度；利用水迷宮及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)及空間學(xué)習(xí)記憶能力。研究發(fā)現(xiàn),特異性阻斷Tim-3的作用可顯著減輕缺氧缺血刺激后小鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng),對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究的實(shí)施與完成,首次揭示新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中的作用及其分子機(jī)制,為新生兒缺氧缺血性腦病的病理機(jī)制研究及臨床治療策略提供了新的思路,具有重要的理論研究及臨床應(yīng)用價(jià)值。研究目的：本研究利用HIBD動(dòng)物模型和體外細(xì)胞模型,以缺氧缺血再灌注過程中,激活的腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,探討該病理過程中Tim-3的表達(dá),及其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),深入探討Tim-3在缺氧缺血誘導(dǎo)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)及缺血缺氧敏感神經(jīng)元死亡中發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制。研究方法：1、Tim-3表達(dá)與HIBD損傷程度相關(guān)性研究：1) HIBD動(dòng)物模型構(gòu)建方法：新生7天C57小鼠結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈,8%氧氣環(huán)境下缺氧1.5小時(shí),3大后灌流取腦。2) Western Blot、RT-PCR、免疫熒光方法檢測(cè)HIBD動(dòng)物模型中Tim-3表達(dá)。3) RT-PCR方法檢測(cè)HIBD動(dòng)物模型中TNF-α等細(xì)胞因子及iNOS表達(dá)量。4) HE、TUNEL方法檢測(cè)腦損傷程度。2、Tim-3對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究：2. 1、OGD/R刺激BV2細(xì)胞后Tim-3的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌：1) OGD/R模型構(gòu)建：給予BV2細(xì)胞不含葡萄糖和血清的1640培養(yǎng)基,1%氧氣環(huán)境下培養(yǎng)3h,更換正常培養(yǎng)基,在正常培養(yǎng)條件下復(fù)氧36h。2) Western Blot、RT-PCR、免疫熒光方法檢測(cè)Tim-3表達(dá)。3) RT-PCR方法檢測(cè)TNF-α等細(xì)胞因子及iNOS表達(dá)量。2.2、Tim-3對(duì)BV2分泌細(xì)胞因子的影響：1)構(gòu)建BV2細(xì)胞Tim-3過表達(dá)、敲減及抗體阻斷模型,給予OGD/R刺激。2) RT-PCR方法檢測(cè)TNF-α等細(xì)胞因子及iNOS表達(dá)量。3) ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α等細(xì)胞因子及NO含量。2.3、Tim-3下游部分信號(hào)通路：構(gòu)建BV2細(xì)胞Tim-3過表達(dá)、敲減模型,給予OGD/R刺激,Western Blot檢測(cè)Tim-3下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。3、阻斷Tim-3對(duì)HIBD損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用：1) HIBD模型構(gòu)建成功后,給予Tim-3阻斷抗體5mg/kg腹腔注射,連續(xù)3天,對(duì)照組給予同型IgG抗體。同時(shí)應(yīng)用Tim-3mut小鼠構(gòu)建動(dòng)物模型。3天后灌流取腦。2) TUNEL方法檢測(cè)小鼠腦損傷程度。3) RT-PCR方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)TNF-α等細(xì)胞因子及iNOS表達(dá)量。4) Tim-3mut組小鼠及其對(duì)照組野生型小鼠構(gòu)建HIBD模型,飼養(yǎng)到4周,進(jìn)行水迷宮及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)及空間學(xué)習(xí)記憶能力。研究結(jié)果：1、Tim-3表達(dá)與HIBD損傷程度相關(guān)性研究：1)HIBD動(dòng)物缺血側(cè)腦內(nèi)大腦皮層、海馬及紋狀體等缺血敏感區(qū)Tim-3表達(dá)升高,炎性細(xì)胞因子及iNOS的mRNA表達(dá)量也均升高。2)Tim-3陽性細(xì)胞與CDllb陽性細(xì)胞幾乎完全重合,提示HIBD動(dòng)物模型中,Tim-3主要來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞。2、Tim-3對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究：1)在BV2細(xì)胞Tim-3過表達(dá)、敲減及抗體阻斷模型中,TNF-α等炎性細(xì)胞因子及NO的分泌量隨Tim-3表達(dá)量改變而改變。2) NF-κB磷酸化程度隨Tim-3表達(dá)量改變而改變。3、阻斷Tim-3對(duì)HIBD損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用：1)給予Tim-3阻斷抗體或應(yīng)用Tim-3敲基因鼠構(gòu)建HIBD模型后,小鼠腦內(nèi)缺血敏感區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少。2)給予Tim-3阻斷抗體或應(yīng)用Tim-3敲基因鼠構(gòu)建HIBD模型后,小鼠腦組織中TNF-α等炎性細(xì)胞因子及iNOS的mRNA表達(dá)量降低。3) Tim-3mu組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較野生型小鼠顯著提高。結(jié)論：1、在圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦損傷中,缺血敏感區(qū)如大腦皮層、海馬及紋狀體區(qū)Tim-3的表達(dá)增加,可能是導(dǎo)致選擇性神經(jīng)元凋亡的重要原因之一。2、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)Tim-3的主要來源。Tim-3可通過NF-κB途徑,增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α, IL-1β等促炎因子及iNOS的表達(dá),介導(dǎo)缺氧缺血再灌注后腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。3、特異性阻斷Tim-3的作用后,對(duì)圍產(chǎn)期缺血缺氧再灌注損傷神經(jīng)元可產(chǎn)生保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy HIE) 缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage HIBD) Tim-3(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3) 小膠質(zhì)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R714.7
【目錄】：

• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 符號(hào)說明17-18
• 前言18-26
• 一、圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病18-20
• 二、HIE中小膠質(zhì)細(xì)胞的作用20-21
• 三、新型免疫調(diào)節(jié)分子Tim-3及其作用21-26
• 第一部分 Tim-3在HIBD動(dòng)物模型中的表達(dá)及定位26-41
• 1、技術(shù)路線26
• 2、材料26-28
• 3、方法28-32
• 4、結(jié)果32-37
• 5、討論37-39
• 6、結(jié)論39-41
• 第二部分 Tim-3對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究41-55
• 1、技術(shù)路線41
• 2、方法41-46
• 3、結(jié)果46-52
• 4、討論52-54
• 5、結(jié)論54-55
• 第三部分 阻斷Tim-3對(duì)HIBD損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用55-65
• 1、技術(shù)路線55
• 2、方法55-57
• 3、結(jié)果57-62
• 4、討論62-64
• 5、結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 碩士期間發(fā)表論文70
• 致謝70-71
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表71

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本文編號(hào)：1118125