本文關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞分泌因子在人MⅡ卵母細(xì)胞的卵丘顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及其與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能關(guān)系的研究

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【摘要】：目的:卵丘顆粒細(xì)胞(Cumulus Cells,CCs)為直接包繞在卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞,分解代謝膽固醇和葡萄糖等物質(zhì),通過與卵母細(xì)胞周圍的縫隙連接為卵母細(xì)胞提供能量,在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟、排卵至受精的整個過程中起著關(guān)鍵性的作用。近年來的研究提示CCs中基因表達(dá)的差異可以作為預(yù)測卵子及胚胎發(fā)育潛能的一種有效的非侵入性方法。GDF-9、BMP-15、TGFβ1均為TGF-β超家族成員,Smads是TGFβ超家族下游信號傳導(dǎo)分子,但是Smad3在CCs中的作用還不確定。GDF-9可以啟動始基卵泡,促進(jìn)卵泡生長,刺激CCs增殖,刺激卵丘膨脹,促進(jìn)透明質(zhì)酸酶合成,調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂能力,提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。BMP-15具有促進(jìn)CCs減數(shù)分裂與增殖的作用,并且其促進(jìn)CCs減數(shù)分裂的作用是不依賴于FSH的。TGFβl通過對CCs上受體的作用而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育和其后的受精分裂潛能,TGFβl對卵子的質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵作用。TGFβ/Smads能促進(jìn)CCs的增殖與分化,和促性腺激素共同調(diào)控卵泡的生長。GDF-9可以刺激人卵巢CCs中Smads蛋白的磷酸化水平升高,與I型受體及II型結(jié)合后激活Smad3,能促進(jìn)CCs增殖。本實(shí)驗(yàn)通過分析單卵母細(xì)胞所對應(yīng)的CCs中GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3的表達(dá)水平,探討上述細(xì)胞因子與卵母細(xì)胞質(zhì)量與發(fā)育潛能的關(guān)系;觀察常規(guī)長方案和微刺激方案2種超促排卵處理方法對細(xì)胞因子表達(dá)的影響,比較2種超排處理方法對卵母細(xì)胞質(zhì)量及其發(fā)育潛能的差異。方法:1研究對象收集2013.10?2014.12期間在石家莊白求恩國際和平醫(yī)院生殖中心接受ICSI助孕治療的患者41例332份CCs,納入標(biāo)準(zhǔn):年齡35歲;雙側(cè)卵巢無手術(shù)史;基礎(chǔ)激素水平正常(月經(jīng)周期第2-3天,FSH10IU/L,E250pg/ml,PRL在正常范圍);月經(jīng)周期正常(26-32天);體重指數(shù)BMI18-25;無其他慢性疾病及內(nèi)分泌疾病,近3個月內(nèi)未應(yīng)用過激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):高雄激素血癥的表現(xiàn);PCOS;子宮內(nèi)膜異位癥。不孕原因主要為男方因素或曾有過IVF不受精史。所有受試患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后,簽署知情同意書。2控制性超促排卵用藥方案(1)患者采用常規(guī)長方案促排卵:在黃體中期開始給予Gn RH-a皮下注射降調(diào)節(jié),達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給以促卵泡成熟激素果納芬進(jìn)行促排卵,啟動劑量一般給予150-300 IU/d皮下注射,根據(jù)患者卵泡發(fā)育情況及卵巢基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)目及時調(diào)整藥物劑量,當(dāng)雙側(cè)卵巢中直徑≥18mm/≥14mm的卵泡為60%-70%,測血清E2/14mm的卵泡為200?300 pg/ml時停藥,給予重組人絨毛膜促性腺激素250μg(r HCG,Ovidre,Merck Serono Switzerland)皮下注射,36h后陰道超聲引導(dǎo)下取卵。(2)患者采用微刺激方案促排卵:在月經(jīng)第3天給予HMG(注射用尿促性素)常規(guī)劑量225IU/天注射,同時給予藥物來曲唑2.5mg/天口服,5天后停用LE,給予CC(氯米芬)50mg/天口服,當(dāng)雙側(cè)卵巢中直徑≥18 mm/≥14mm的卵泡為60%-70%,測血清E2/14mm的卵泡為200?300 pg/ml時停藥,給予達(dá)菲林0.1mg皮下注射,36 h后陰道超聲引導(dǎo)下取卵。3 CCs的留取扳機(jī)36h后陰道超聲引導(dǎo)下取卵,找到卵-冠-丘復(fù)合物(COC),將單COC放入MOPS制成的微滴中,用機(jī)械法小心剝離卵子周圍的CCs,將微滴中的卵丘顆粒細(xì)胞裝入小EP管中,用PH值為7.4的PBS液反復(fù)沖洗,凍存于-80℃冰箱實(shí)驗(yàn)備用。4 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)RNA的提取方法按照Trizole法進(jìn)行,加入20μL DEPC水充分溶解。然后將提取的RNA取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,測定結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)后,從各樣品中提取8μL RNA樣品加入到20μL逆轉(zhuǎn)錄的體系中,按照Reverse Transcription Reaction試劑盒的說明書的操作要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件如下:70℃10min,42℃50min,95℃5min。5實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計目的基因和內(nèi)參基因(RPL-15)引物序列。各基因引物序列見表1。反應(yīng)按照QIAGEN Rotor-Gene Q公司Quanti Fast#174;SYBR#174;Green PCR kit熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行:具體條件設(shè)置如下:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性15s,60℃退火/延伸30s,共40個循環(huán)。運(yùn)算分析最終所得Ct值。6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析將real time RT-PCR所得的Ct值按照公式2ΔCt進(jìn)行運(yùn)算,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,利用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,比較組間細(xì)胞因子水平的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1 CCs根據(jù)促排卵方案不同分為兩組:常規(guī)長方案組(CC=172份)及微刺激組(CC=160份)。因卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞是一一對應(yīng)的,所以根據(jù)每個卵子受精、卵裂及囊胚發(fā)育情況,回顧性將CCs進(jìn)行分組。根據(jù)卵子受精情況將CCs分為正常受精組(長方案組CCs=127份,微刺激方案組CCs=136份)及異常受精組(長方案組CCs=45份,微刺激方案組CCs=24份);正常受精組根據(jù)第3日胚胎卵裂情況分為優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組(長方案組CCs=58份,微刺激方案組CCs=76份)及非優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組(長方案組CCs=69份,微刺激方案組CCs=60份);非優(yōu)質(zhì)卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng),根據(jù)第5日形成囊胚情況,分為優(yōu)質(zhì)囊胚形成組(長方案組CCs=24份,微刺激方案組CCs=12份)及非優(yōu)質(zhì)囊胚形成組(長方案組CCs=45份,微刺激方案組CCs=48份)。未成熟、畸形卵子所對應(yīng)的卵丘顆粒不列入分組研究中。共有41例患者332份(常規(guī)長方案患者21例172份,微刺激方案20例160份)卵丘顆粒細(xì)胞用于RT-PCR檢測。2人卵丘顆粒細(xì)胞中GDF-9與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系GDF-9有利于卵母細(xì)胞受精、卵裂及囊胚的形成。通過本實(shí)驗(yàn)可以看出,2種促排卵方案中,GDF-9 m RNA相對表達(dá)量:正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.020,P=0.001);優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組(P=0.001,P=0.043);優(yōu)質(zhì)囊胚形成組與非優(yōu)質(zhì)囊胚形成組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002,P=0.001)。3人卵丘顆粒細(xì)胞中BMP-15與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系通過本實(shí)驗(yàn)可以看出,不論常規(guī)長方案組還是微刺激方案組,BMP-15 m RNA的相對表達(dá)量在卵母細(xì)胞發(fā)育的不同結(jié)局中均有顯著性差異。2種促排方案中,BMP-15m RNA相對表達(dá)量:正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.000,P=0.000);優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組與非優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組,組間有顯著性差異(P=0.003,P=0.048);優(yōu)質(zhì)囊胚形成組與非優(yōu)質(zhì)囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.033,P=0.029)。可以看出,BMP-15m RNA相對含量與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能成正相關(guān)。4人卵丘顆粒細(xì)胞中TGF-β1與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系TGFβl含量與卵子的質(zhì)量和發(fā)育潛能密切相關(guān)。TGF-β1基因m RNA無論在常規(guī)長方案組還是微刺激方案組中,其相對表達(dá)量在正常受精組中顯著高于異常受精組(P=0.003,P=0.022);優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組(P=0.015,P=0.022);優(yōu)質(zhì)囊胚形成組與非優(yōu)質(zhì)囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.001,P=0.025)。5人卵丘顆粒細(xì)胞中Smad3與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系常規(guī)長方案組及微刺激方案組中,Smad3 m RNA的相對表達(dá)量正常受精組顯著高于異常受精組(P=0.006,P=0.012);優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組與非優(yōu)質(zhì)卵裂胚形成組,組間比較有顯著性差異(P=0.019,P=0.041);優(yōu)質(zhì)囊胚形成組與非優(yōu)質(zhì)囊胚形成組間有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000,P=0.028)�？梢钥闯�,卵丘顆粒細(xì)胞中Smad3 m RNA的含量較高的卵母細(xì)胞有較好的發(fā)育潛能。6不同促排方案與GDF-9、BMP-15、TGF-β1和Smad3表達(dá)量的關(guān)系常規(guī)長方案與微刺激方案中,年齡無統(tǒng)計學(xué)差異。GDF-9和Smad3相對表達(dá)量在常規(guī)長方案組中顯著高于微刺激方案組(P=0.000,P=0.004,P=0.005),BMP-15相對表達(dá)量在微刺激組中顯著高于常規(guī)長方案組(P=0.004),而TGF-β1相對表達(dá)量在常規(guī)長方案組中和微刺激方案組中無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.653)。提示GDF-9、BMP-15和Smad3因子在CCs中的表達(dá)量與促排卵方案有關(guān),常規(guī)長方案組可以刺激CCs分泌更多的GDF-9和Smad3因子,微刺激方案組可以刺激CCs分泌更多的BMP-15因子,TGF-β1相對含量與促排卵方案無關(guān)。結(jié)論:1 GDF-9、BMP-15、TGF-β1、Smad3在卵丘顆粒細(xì)胞中的相對表達(dá)量與卵母細(xì)胞質(zhì)量及發(fā)育潛能成正相關(guān),提示其可以作為評價卵母細(xì)胞質(zhì)量、預(yù)測卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能的客觀指標(biāo)。2不同的促排卵方案可能影響卵丘顆粒細(xì)胞中的卵母細(xì)胞因子表達(dá)譜,且與MⅡ期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：卵母細(xì)胞分泌因子 人卵丘顆粒細(xì)胞 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射 胚胎發(fā)育潛能 卵母細(xì)胞質(zhì)量 常規(guī)長方案 微刺激方案
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-16
• 英文縮寫16-17
• 前言17-18
• 材料與方法18-28
• 結(jié)果28-33
• 附圖33-37
• 附表37-42
• 討論42-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 綜述53-64
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 致謝64-65
• 個人簡歷65

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10 許衛(wèi)華;牛卵泡卵母細(xì)胞冷凍保存的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

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本文編號：1073356