本文關(guān)鍵詞：WTH3表達(dá)對人卵巢癌細(xì)胞耐藥性影響的研究

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【摘要】：研究背景 化療作為一種重要的治療手段廣泛的應(yīng)用在腫瘤的治療中，但腫瘤耐藥性的發(fā)生成為化療失敗的主要原因。它的發(fā)生發(fā)展是眾多因素共同作用參與的結(jié)果，在腫瘤耐藥的發(fā)生機(jī)制中，表觀遺傳學(xué)調(diào)控具有重要作用，DNA甲基化為表觀遺傳學(xué)的一種，在近幾十年間，人們對DNA甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究越來越廣泛與深入，探尋并獲得這些細(xì)胞事件與生物學(xué)機(jī)制中我們所未知的信息有助于我們解決腫瘤治療中的難題，并為腫瘤的臨床治療提供了一個(gè)新思路。 研究表明，DNA甲基化在很大程度上影響著腫瘤和腫瘤耐藥的發(fā)生，腫瘤的發(fā)生過程中常伴有DNA的甲基化異常，最常見的就是基因序列局部區(qū)域的高甲基化，高甲基化異常主要發(fā)生在人類基因組中的CpG島上， CpG主要存在于基因的5'區(qū)，具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的重要作用，當(dāng)基因甲基化狀態(tài)發(fā)生改變時(shí)則會導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常，從而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生疾病。 WTH3是人們在用甲基化敏感性代表性差異分析法研究MDR時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可能的抗耐藥基因，在人類乳腺癌耐藥細(xì)胞株（MCF7/AdrR）中WTH3啟動子區(qū)高甲基化，WTH3不表達(dá)，而在人類乳腺癌非耐藥細(xì)胞株（MCF7/WT）中則相反。對其的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WTH3參與多種耐藥細(xì)胞系耐藥性的發(fā)生。對MES-SA/Dx5（一種子宮肉瘤）、MCF7/AdrR和早期耐藥乳腺癌上皮細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)WTH3在以上細(xì)胞中都低表達(dá)，且其啟動子區(qū)發(fā)生了超甲基化，之后將WTH3重新導(dǎo)入以上細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)耐藥基因MDR1的表達(dá)下降，并增加了以上腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，當(dāng)在人胚腎上皮細(xì)胞293（human embryonickidney293，HEK293）中沉默了WTH3的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)多藥耐藥基因（MDR1）的表達(dá)上調(diào)，這表明耐藥基因MDR1的表達(dá)與WTH3的表達(dá)負(fù)相關(guān)，WTH3可以作為一種抗耐藥基因參與腫瘤耐藥的發(fā)生過程。 本文主要研究WTH3在人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，人卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株SKOV3/DDP中的表達(dá)情況，通過亞硫酸氫鹽直接克隆測序法檢測兩種細(xì)胞系中WTH3啟動子區(qū)的甲基化水平，之后通過重組質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)導(dǎo)方法探究WTH3的表達(dá)對腫瘤耐藥性的影響。為今后我們腫瘤的耐藥性研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 方法 本實(shí)驗(yàn)選取SKOV3和SKOV3/DDP作為研究對象，采用RT-PCR技術(shù)檢測兩種細(xì)胞系中WTH3mRNA表達(dá)情況；采用亞硫酸鹽直接克隆測序法檢測在兩種細(xì)胞系中基因組啟動子區(qū)的甲基化水平，，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES2 EGFP-WTH3，將WTH3轉(zhuǎn)導(dǎo)到SKOV3/DDP細(xì)胞中以研究WTH3的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。 結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，WTH3mRNA在SKOV3中高表達(dá)，在SKOV3/DDP中不表達(dá)。亞硫酸氫鹽直接克隆測序法結(jié)果顯示，SKOV3和SKOV3/DDP兩種細(xì)胞系中WTH3啟動子區(qū)的甲基化水平分別為0-13％，78％-91.3％，有顯著差異。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入SKOV3/DDP細(xì)胞中后，抗腫瘤藥物順鉑對其抑制作用明顯增加。 結(jié)論 1.WTH3在非耐藥的SKOV3細(xì)胞中表達(dá)陽性，在耐藥的SKOV3/DDP中表達(dá)陰性，推測WTH3的表達(dá)與細(xì)胞耐藥具有相關(guān)性。 2.WTH3啟動子甲基化水平在SKOV3和SKOV3/DDP中有著顯著差別，在SKOV3/DDP細(xì)胞系中其啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化改變，推測其啟動子區(qū)甲基化水平對WTH3的表達(dá)密切相關(guān)。 3.導(dǎo)入重組質(zhì)粒pIRES2 EGFP-WTH3的SKOV3/DDP對抗腫瘤藥物的敏感性明顯增加，耐藥性降低，表明WTH3的表達(dá)可改變腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的耐藥性，并可作為調(diào)控多藥耐藥（MDR）的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基化 WTH3 MDR 人卵巢癌細(xì)胞株
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 第1章 緒論13-20
• 1.1 DNA 甲基化13-15
• 1.1.1 DNA 甲基化與表觀遺傳學(xué)13
• 1.1.2 DNA 甲基化與 CpG 島13-14
• 1.1.3 DNA 甲基化與腫瘤14-15
• 1.1.4 DNA 甲基化的檢測方法15
• 1.2 腫瘤耐藥15-17
• 1.2.1 腫瘤耐藥的分類15-16
• 1.2.2 MDR 的耐藥機(jī)制16-17
• 1.3 WTH317-20
• 1.3.1 WTH3 的分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布17
• 1.3.2 WTH3 與 MDR 的關(guān)系17-18
• 1.3.3 WTH3 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制18-20
• 第2章 材料與方法20-39
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-24
• 2.1.1 細(xì)胞系20
• 2.1.2 主要儀器及設(shè)備20-21
• 2.1.3 主要試劑21
• 2.1.4 主要試劑配制21-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-39
• 2.2.0 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存24
• 2.2.1 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞生長情況測定24-25
• 2.2.2 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞中 RNA 的提取25-26
• 2.2.3 RT-PCR 檢測 WTH3 的表達(dá)26-28
• 2.2.4 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞中 DNA 提取28-29
• 2.2.5 基因組 DNA 的甲基化修飾29-30
• 2.2.6 基因組 DNA 修飾后 PCR 擴(kuò)增 WTH3 啟動子區(qū)域30-31
• 2.2.7 PCR 產(chǎn)物目的片段回收31-32
• 2.2.8 目的 DNA 片段與 T 載體連接32-33
• 2.2.9 CaCl2 法感受態(tài)細(xì)胞制備33
• 2.2.10 細(xì)胞轉(zhuǎn)化33-34
• 2.2.11 克隆細(xì)胞鑒定34-35
• 2.2.12 克隆細(xì)胞擴(kuò)增、測序35
• 2.2.13 WTH3 表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建35-39
• 第3章 結(jié)果39-48
• 3.1 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞的培養(yǎng)39-41
• 3.2 WTH3MRNA 在 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞中的表達(dá)及啟動子區(qū)的甲基化41-44
• 3.2.1 WTH3 在 SKOV3,SKOV3/DDP 細(xì)胞中的表達(dá)41
• 3.2.2 基因組 DNA 修飾后 PCR 擴(kuò)增 WTH3 啟動子區(qū)域41-42
• 3.2.3 PCR 鑒定連接情況42
• 3.2.4 WTH3 啟動子區(qū)42
• 3.2.5 甲基化位點(diǎn)測序結(jié)果42-44
• 3.3 重組質(zhì)粒 PIRES2 EGFP-WTH3 的構(gòu)建和表達(dá)44-48
• 3.3.1 WTH3 目的基因片段44
• 3.3.2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定44-45
• 3.3.3 測序45
• 3.3.4 轉(zhuǎn)染后 EGFP 表達(dá)的檢測45-46
• 3.3.5 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后 SKOV3/DDP 細(xì)胞中 WTH3mRNA 的表達(dá)46
• 3.3.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對腫瘤藥物的敏感性46-48
• 第4章 討論48-51
• 4.1 WTH3MRNA 在 SKOV3、SKOV3/DDP 中的表達(dá)48-49
• 4.2 WTH3 啟動子區(qū)域甲基化水平的檢測49-50
• 4.3 重組質(zhì)粒 pIRES2 EGFP-WTH3 的構(gòu)建和表達(dá)對 SKOV3/DDP耐藥性影響的檢測50-51
• 第5章 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 作者簡介56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 文玉;李曉燕;;DNA甲基化與結(jié)直腸癌[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年17期

本文編號：1065520