本文關(guān)鍵詞：小兒神經(jīng)母細胞瘤血清特異性蛋白的篩選與鑒定

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【摘要】：研究背景 神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma,NB）最常見的顱外惡性實體腫瘤之一，占所有兒童腫瘤8%～10%，一些高發(fā)地區(qū)如法國、以色列瑞士、新西蘭等的年發(fā)病率達11/100萬(0～15歲)，美國為25/100萬，中國和印度的報道均低于5/100萬。NB是起源于胚胎神經(jīng)嵴的交感神經(jīng)元細胞，形態(tài)為藍色小圓細胞，因其早期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，并且其發(fā)生的部位隱匿，很難在疾病早期診斷，且腫瘤生長速度十分迅速，加上腫瘤惡性程度極高，在疾病早期便可發(fā)生多處的轉(zhuǎn)移，在臨床表現(xiàn)出多樣化，容易被漏診、誤診，和延誤治療，所以患兒生存率很低。根據(jù)腫瘤發(fā)生部位、發(fā)病年齡以及不同的組織分化程度，臨床表現(xiàn)有很大的差異，有一部分腫瘤會轉(zhuǎn)化成良性腫瘤，但是其他部分的患者，將面對艱難的治療過程和讓人絕望的預(yù)后。目前，對于嬰兒型或早期NB預(yù)后有了可喜的改善，遺憾的是，在對大年齡、晚期患兒的預(yù)后仍然極差。在諸多可影響NB的因素中，最重要的影響因素是年齡與分期。65%的患兒腫瘤原發(fā)于腹腔，大年齡兒童中腎上腺原發(fā)占40%，而在嬰兒中只占25%。胸腔和頸部也較常見。其余約有10%的病例原發(fā)部位不明。極少數(shù)有10歲以后發(fā)病，多數(shù)在5歲發(fā)病約占70%。目前對NB的臨床診斷主要還是針對可疑部位進行B超、CT及MRI等檢查，有轉(zhuǎn)移的患兒，必須行骨髓檢查，查找NB細胞；可疑骨轉(zhuǎn)移的患兒，進行X線或者CT檢查或者行放射性核素掃描等，腫瘤經(jīng)皮穿刺取活檢，或者術(shù)中活檢，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小圓形NB細胞，可確診。生物學(xué)特性檢測如尿香草扁桃酸(VMA)高香草酸(HVA)顯著增高。目前NB的治療無統(tǒng)一的規(guī)范方案和具體措施，治療方案較為繁復(fù)，且仍在完善和探索中。根據(jù)INSS所定臨床分期和COG風(fēng)險分組情況來確定治療方法。手術(shù)治療與放射治療抑或生物治療是目前主流治療方法，預(yù)后多與腫瘤的分期呈負相關(guān)，由此可見神經(jīng)母細胞瘤患兒的早期診斷、早期治療，對提高療效以及改善預(yù)后有著重要作用。目前血清學(xué)檢查是最簡單易行無損傷的檢查方式，血清中腫瘤標(biāo)志物的變化往往會早于影像學(xué)的表現(xiàn)。NB病中，單個指標(biāo)檢測陽性率和特異性不高，各個腫瘤標(biāo)志物聯(lián)檢可提高腫瘤診斷的準確性和靈敏性，NES（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）為目前NB診斷的首選腫瘤標(biāo)志物，可聯(lián)合LDH（乳酸脫氫酶）、SF（血清鐵蛋白）血清標(biāo)記物，在神經(jīng)母細胞瘤臨床分期、療效評價及判斷復(fù)發(fā)等方面提供重要的實驗室依據(jù)。為了讓神經(jīng)母細胞瘤患兒在早期診斷，及時治療，我們迫切的需要一種具有高敏感性、高特異性，簡單易行的診斷方法。 蛋白質(zhì)組學(xué)是醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展的前沿，國際人類基因組計劃已經(jīng)完成，目前科研人員也在逐漸的完善著蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，將各種質(zhì)譜技術(shù)的串聯(lián)，用于鑒定蛋白質(zhì)，常用的搜庫軟件，具備了快速、準確的、有效的肽段鑒定的能力，進而獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)信息。1994年提出了蛋白質(zhì)組學(xué)這一概念，馬上獲得了大量的研究和認可。在大量樣本的情況下通過特殊的方法研究蛋白質(zhì)的特征是蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)。所有的疾病、任何機體活動，無論是量變還是質(zhì)變，在蛋白質(zhì)水平上都會有變化。所有，我們可以應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)，對機體蛋白質(zhì)進行檢測，發(fā)現(xiàn)特異性變化的蛋白質(zhì)，可以作為一種早期診斷的方法。研究的核心問題是找尋疾病對應(yīng)的特異性蛋白質(zhì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的更新發(fā)展，多種蛋白質(zhì)標(biāo)記物被檢測出并加以鑒定。蛋白質(zhì)組學(xué)研究對象包括蛋白與蛋白相互作用、翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)的表達水平等，發(fā)展以及特殊改變的蛋白質(zhì)，分析其結(jié)構(gòu)和功能，可作為早期診斷以及預(yù)后指標(biāo)，服務(wù)于臨床醫(yī)療。 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MELDI-TOF-MS）技術(shù)，將質(zhì)譜與色層分析技術(shù)完美融合，具有更高的分辨率，更先進的軟電離技術(shù)，增強了分離能力，使待測分子不會產(chǎn)生碎片，基質(zhì)利用親和力來捕獲疏水性、親水性、離子螯合和與金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)或者其它分子，以獲取所需蛋白質(zhì)的分子量、等電點、糖基化位點和磷酸化位點等重要資料。在蛋白質(zhì)譜技術(shù)中，可以對微量的樣本血清進行分析，目標(biāo)蛋白多集中在10kDa內(nèi)，樣品的離子在儀器場中的飛行時間不同，經(jīng)過軟件處理可形成模擬譜圖，直觀的顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的分子量和含量。將疾病組與對照組的譜圖進行比較，很直觀的就可以發(fā)現(xiàn)和捕獲疾病特異性相關(guān)蛋白質(zhì)。 本實驗應(yīng)用MELDI-TOF-MS技術(shù)檢測神經(jīng)母細胞瘤患兒術(shù)前血清與健康體檢童兒血清中的蛋白，篩選出特異性表達的非炎性蛋白質(zhì)，并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)及數(shù)據(jù)庫搜索對篩選出的特異性蛋白質(zhì)進行鑒定，通過對神經(jīng)母細胞瘤患兒的術(shù)前病例血清及健康兒童血清中對蛋白質(zhì)定性的比較分析，篩選并鑒定神經(jīng)母細胞瘤患兒血清中非炎性特異性表達的蛋白質(zhì)。 研究目的 篩選并鑒定小兒神經(jīng)母細胞瘤血清非炎性特異性蛋白，構(gòu)建更為完善的早期診斷血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。為下步對神經(jīng)母細胞瘤的診斷及治療打下前瞻。 材料與方法 材料：血清樣本收集與處理 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年至2013年神經(jīng)母細胞瘤患兒術(shù)前血清樣本30例，其中男18例，女12例，年齡3~13歲，平均6.0+0.5歲，收集正常體檢兒童血清30例，與神經(jīng)母細胞瘤患兒年齡、性別相匹配。全身炎癥反應(yīng)綜合(SIRS)患兒20例，男12例，，女8例，平均年齡3.5+0.1歲。所有血清標(biāo)本均是清晨空腹抽取室溫靜置0.5-1h，3000r/min離心15min，取上清液后，立即放入-80℃冰箱保存。 方法：將處理好的血清標(biāo)本解凍，經(jīng)過弱陽因子（WCX）磁珠處理，往處理好的樣品中添加基質(zhì)，點在蛋白質(zhì)芯片板上，編輯讀片操作程序，最高分子量設(shè)在30000Da，其最佳范圍設(shè)為2000Da~20000Da，設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，調(diào)節(jié)設(shè)置最佳激光能量及檢測靈敏度。參數(shù)調(diào)節(jié)完畢后，將芯片板裝入質(zhì)譜儀，利用MELDI-TOF-MS平臺，收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用軟件處理數(shù)據(jù)，得到各樣本中的m/z峰，其中差異小于0.3%的考慮為一類。在結(jié)果收集完畢后，將不同組間的m/z峰值的數(shù)據(jù)運用Wilcoxon秩和檢驗，P值越小，其表達強度的差異就越大，表明這兩組不同的樣本的差異越有研究意義。腫瘤組與正常組、SIRS組與正常組中均得到兩組差異性m/z峰值，范圍+0.3%，進而發(fā)現(xiàn)在腫瘤血清和正常小兒血清、SIRS患兒與正常組患兒間的差異性蛋白。篩選完畢后，制備膠體，收集腫瘤血清2ml，加入超純水稀釋到5ml，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，分離結(jié)束后在對應(yīng)的分子量軸上切膠，分裝至不同的EP管中，根據(jù)膠內(nèi)酶解試劑盒說明書，酶解出目標(biāo)蛋白。加入提取液后，提取上清液。將上清液添加基質(zhì)后，在蛋白質(zhì)芯片板上點樣，放入MALDI-TOF/TOF，通過激光轟擊，收集肽段序列，然后通過Mascot軟件，與SwissProt數(shù)據(jù)庫連接、匹配及比對，最終得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。 結(jié)果 1.神經(jīng)母細胞瘤血清組與正常對著組的數(shù)據(jù)經(jīng)過濾篩選后得出P值小于0.01的m/z峰11個，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，在有顯著差異的蛋白質(zhì)峰任意組合中，應(yīng)用SVM篩選出預(yù)測值的陽性率與陰性率之差（youden指數(shù)）最高的組合模型，篩選出m/z位于5920的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，在神經(jīng)母細胞瘤術(shù)前組高表達(強度為6180.6±2328.0)，正常小兒組明顯低表達(強度為419.1±493.0)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。 2. SIRS組與對照組數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，得出P0.01的特異性高表達6個，低表達4個，同樣參考youden指數(shù)最高的模型，得到m/z位于5747的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，在炎癥組中高表達（強度為514.2±361.3），正常組明顯低表達（強度24.6±13.4），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.通過對兩組結(jié)果的比較，峰值位于5920的蛋白質(zhì)在炎癥組與正常組的比較結(jié)果中，未發(fā)現(xiàn)近似值（范圍+0.3%），確定腫瘤特異蛋白5920為非炎性蛋白。 4.利用MALDI-TOF/TOF平臺對經(jīng)過分離、純化、酶解的肽段混合物進行檢測，m/z峰位于5920的蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定為類Apo C-III（類載脂蛋白C-III）. 結(jié)論 M/z峰位于5920的蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定為類Apo C-III，與現(xiàn)行臨床常用的NES，LDH，SF等腫瘤標(biāo)志物可聯(lián)用，組成完善的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，對神經(jīng)母細胞瘤早期診斷、手術(shù)效果及預(yù)后監(jiān)測具有重要意義。Apo C-III在小兒神經(jīng)母細胞瘤血清中的發(fā)現(xiàn)，實驗結(jié)果證明腫瘤血清中存在類脂化合物，對于后期研究脂類代謝與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)母細胞瘤 蛋白質(zhì)組學(xué) 類載脂蛋白CIII 類Apo C-III
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文縮略詞16-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-25
• 結(jié)果25-29
• 討論29-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻36-39
• 綜述39-55
• 參考文獻51-55
• 個人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文55-56
• 1 一般情況55
• 2 學(xué)習(xí)經(jīng)歷55
• 3 在學(xué)期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文55-56
• 致謝56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 白先慧;脂肪肝患者血清載脂蛋白CⅢ檢測的臨床意義[J];廣西醫(yī)學(xué);1997年03期

2 張志泉;俞娟;陳連英;于婷;劉才旺;王惠民;;高甘油三酯血癥患者血清載脂蛋白CⅢ含量分析[J];南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年01期

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本文編號：960977