本文關(guān)鍵詞：CXCL16基因沉默在減輕ox-LDL引起的足細胞損傷中的作用研究

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【摘要】：研究背景與研究目的原發(fā)性腎病綜合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)是兒童時期常見的腎小球疾病之一,約占小兒時期腎病綜合征(Nephrotic syndrome, NS)的90%。高脂血癥和高脂蛋白血癥是PNS重要的病理生理特征之一。研究表明,氧化應激、炎癥應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等是引起慢性腎臟疾病的可能機制。脂質(zhì)在腎臟的過多沉積將致使腎功能障礙,然而,脂質(zhì)引起腎臟損傷的具體機制尚未明確。近年來研究表明,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)對腎臟系膜細胞、內(nèi)皮細胞以及足細胞均可造成損傷。在許多腎小球疾病中,如糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)、微小病變腎病綜合征(Minimal change disease nephrotic syndrome, MCNS)、局灶性節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomerular sclerosis, FSGS)及膜性腎病(Membranous nephropathy, MN),足細胞是最主要的受損部位和早損指標。足細胞是高度分化的腎臟固有細胞,其通過足突覆蓋于腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)表面,構(gòu)成腎小球濾過的最后屏障。當足細胞受到損傷時,將導致蛋白尿的產(chǎn)生。目前,ox-LDL引起足細胞損傷的機制尚不明確。CXC趨化因子配體16 (chemokine ligand 16, CXCL16)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,其集清道夫受體功能及炎性趨化因子功能于一身,是CXC趨化因子家族中獨特的一種,在免疫反應及炎癥等多方面有重要作用。早期對于CXCL16的研究主要集中于動脈粥樣硬化。近期研究發(fā)現(xiàn)CXCL16參與了多種腎臟疾病的疾病過程[4-5]。本課題前期研究顯示,CXCL16參與阿霉素腎病,其可能作為ox-LDL的清道夫受體,協(xié)助足細胞攝取ox-LDL[6]。然而,在原發(fā)性腎病綜合征中,CXCL16介導ox-LDL引起足細胞損傷的具體機制尚不明確。脫落和凋亡是目前已知的足細胞減少的主要原因。β1整合素是足細胞基底膜上重要的粘附分子,其與足細胞的粘附功能及脫落有重要聯(lián)系并且在細胞內(nèi)外信號傳導中發(fā)揮作用。β1整合素表達量的下降可導致足細胞黏附力降低引起足細胞脫落,足細胞脫落與腎小球硬化有重要聯(lián)系。Chen等報道β1整合素表達量的減少伴有足細胞數(shù)量的減少。關(guān)于足細胞凋亡,活性氧(reactive oxygen species, ROS)是近來的研究熱點之一。足細胞是終末分化細胞,其內(nèi)有大量的線粒體存在以維持其對能量的需求。當線粒體受到損傷時,必定引起足細胞的功能障礙。當細胞受損時,線粒體外膜通透性增加,可引起細胞凋亡,氧化呼吸鏈上電子丟失使部分氧形成ROS。線粒體的損傷及ROS的產(chǎn)生可進一步導致足細胞的損傷及大量ROS的形成,導致惡性循環(huán)。目前,在PNS中,關(guān)于CXCL16是否通過介導ox-LDL進入足細胞引起ROS以及β1整合素變化,國內(nèi)外尚未有所研究。為此,本實驗通過慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠足細胞,建立小鼠足細胞CXCL16基因沉默模型,觀察ox-LDL作用下足細胞β1整合素及ROS的表達變化,探討CXCL16在ox-LDL引起足細胞損傷的機制。研究CXCL16基因沉默后,能否減少ox-LDL引起的細胞損傷而發(fā)揮細胞保護作用。方法體外培養(yǎng)永生化小鼠足細胞,CXCL16-shRNA慢病毒及陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染足細胞建模,熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效果,Western blotting及Real-time PCR檢測CXCL16沉默效率。CCK8法檢測陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染組(NC組)及CXCL16-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組(CXCL16-shRNA組)足細胞活力差異。將NC組及CXCL16-shRNA組分別用ox-LDL處理,總膽固醇含量測定估計細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,Western blotting檢測CXCL16及β1整合素變化,ROS深紅色染料檢測ROS表達。結(jié)果1.慢病毒轉(zhuǎn)染效果 以MOI=50進行轉(zhuǎn)染后可見明顯綠色熒光,且MOI=50時細胞狀態(tài)良好,確定足細胞的最優(yōu)MOI為50。為保持細胞在增值過程中轉(zhuǎn)染率,采用二鹽酸嘌呤霉素對其篩選,根據(jù)預實驗確定嘌呤霉素1ug/mL對篩選轉(zhuǎn)染細胞,篩選后熒光觀察感染率90%。2.CXCL16-shRNA慢病毒感染效率慢病毒轉(zhuǎn)染及二鹽酸嘌呤霉素篩選后,CXCL16-shRNA組較NC組CXCL16蛋白表達水平顯著下降(Z=2.61,P0.05),蛋白表達水平下降約60%；CXCL16-shRNA組較NC組CXCL16 mRNA表達水平顯著下降(Z.-2.61,P0.05),mRNA表達水平下降約70%。3.足細胞活力測定 陰性對照轉(zhuǎn)染組及CXCL16-shRNA組足細胞活力無顯著差異(Z=0.369,P0.05)。4.細胞內(nèi)總膽固醇含量ox-LDL作用后,24h至72h細胞內(nèi)總膽固醇含量增加。作用72h,ox-LDL組總膽固醇含量明顯增加,ox-LDL組細胞內(nèi)總膽固醇含量高于NC組、CXCL16-shRNA組、ox-LDL+CXCL16-shRNA組(P0.05).5.ox-LDL處理后CXCL16及β1整合素表達量變化ox-LDL處理48h后,CXCL16表達量增加,隨時間延長無顯著增加(F=19.24,P0.05)。β1整合素在處理48h后出現(xiàn)減少,隨時間延長表達進一步減少,72h有明顯減少(F=54.15,P0.001)。ox-LDL處理72h后,ox-LDL組及ox-LDL+CXCL16-shRNA組均有β1整合素表達量下降,且ox-LDL組低于NC、CXCL16-shRNA. ox-LDL+CXCL16-shRNA組,差異有統(tǒng)計學意義(F=51.12,P0.001)。6.細胞內(nèi)ROS測定通過熒光強度檢測ox-LDL作用下ROS的產(chǎn)生,陰性對照轉(zhuǎn)染組、CXCL16-shRNA組、ox-LDL+CXCL 16-shRNA轉(zhuǎn)染組ROS表達量均少于ox-LDL組,差異有統(tǒng)計學意義(F=307.57,P0.001)。結(jié)論1.MOI=50時可獲得滿意的病毒轉(zhuǎn)染效果,提示以MOI=50轉(zhuǎn)染40-48h進行造模。2.與陰性對照相比,CXCL16-shRNA轉(zhuǎn)染組足細胞CXCL16蛋白表達明顯減少,提示建模成功。3.與陰性對照相比,CXCL16-shRNA轉(zhuǎn)染組足細胞活力無顯著性差異,提示兩組細胞活性無差異,可進一步探討ox-LDL作用下的兩組細胞的損傷差異。4.在ox-LDL作用下,陰性對照組細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯高于CXCL16-shRNA轉(zhuǎn)染組足細胞,差異有統(tǒng)計學意義,提示CXCL16基因沉默后,脂質(zhì)的攝取減少,CXCL16是ox-LDL的清道夫受體。5.在ox-LDL作用后,細胞內(nèi)ROS表達增加,p1整合素表達降低,提示ox-LDL可通過改變ROS及p1整合素的表達而損傷足細胞。6.CXCL16基因沉默后,ROS產(chǎn)生減少,β1整合素表達增加,提示CXCL16基因沉默能減輕ox-LDL對足細胞的損傷,起到細胞保護作用。
【關(guān)鍵詞】：足細胞 CXC趨化因子配體16 氧化低密度脂蛋白 活性氧 β1整合素
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R726.9
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符號說明14-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-31
• 結(jié)果31-33
• 討論33-39
• 結(jié)論39-40
• 創(chuàng)新性與局限性40-41
• 附表41-42
• 附圖42-45
• 參考文獻45-49
• 致謝49-50
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄50-51
• 學位論文評閱及答辯情況表51

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