發(fā)布時間：2017-09-21 13:52

  本文關(guān)鍵詞：白介素-1β對膿毒癥新生幼鼠胼胝體內(nèi)少突膠質(zhì)細胞前體細胞分化成熟的影響及機制探討

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【摘要】：新生兒膿毒血癥是臨床常見的重癥疾病,可引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良,甚至腦癱。近年來有研究表明感染激發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)是導致腦室周邊腦白質(zhì)損傷(Periventicular White Matter Damage,PWMD)的機制之一,腦白質(zhì)損傷可出現(xiàn)髓鞘完整性的破壞及神經(jīng)信號傳導異常,這可能是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良的機制之一。髓鞘的完整性是神經(jīng)電信號高效傳導的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其形成過程包括少突膠質(zhì)細胞的幼稚細胞,即少突前體細胞(Oligodendrcyte Precuror Cells,OPCs)的成熟發(fā)育、發(fā)育成熟的神經(jīng)元軸突、兩者相互纏繞、粘附。其中OPCs是構(gòu)成髓鞘的重要細胞,OPCs的發(fā)育過程比較復雜,包括(1)O-2A前體細胞時期；(2)O-2A祖細胞時期；(3)少突前體時期；(4)不成熟少突時期；(5)成熟少突時期。有研究表明少突膠質(zhì)細胞前體細胞較神經(jīng)元細胞更易損傷,因此機體內(nèi)環(huán)境的變化可能會引起OPCs分化障礙。小膠質(zhì)細胞是大腦中的免疫細胞,當它暴露于LPS和缺氧的情況下,會迅速釋放過多的炎癥介質(zhì),改變了靶細胞的內(nèi)環(huán)境。這些因子干擾了正常的軸突髓鞘化過程和成熟型OPCs(預OLS)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)缺氧導致的腦內(nèi)炎癥可以引起軸突髓鞘化障礙,可能由于炎癥因子及其相應(yīng)受體相互作用引起,如白介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)和IL-1R1 (IL-1 recptor 1),但炎癥因子的具體作用及機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射IL-1β可引小鼠的幼鼠少突膠質(zhì)細胞發(fā)育障礙,導致軸突低髓鞘化,但具體機制不明,且是否存在種屬差異并不明確。IL-1β在OPCs的發(fā)育中起何種作用,IL-1R抑制劑是否有其臨床應(yīng)用價值,需要進一步的研究來探討。本研究旨在探討膿毒癥對新生大鼠OPCs發(fā)育的影響及IL-1p在其中的作用及機制探討。因此,進行腹腔注射LPS誘導膿毒癥大鼠模型,觀察膿毒癥大鼠胼胝體內(nèi)IL-1p的表達及OPCs早期凋亡與增殖以及后期分化及軸突髓鞘化情況,從而證實膿毒癥新生大鼠出現(xiàn)OPCs的發(fā)育障礙。為了明確IL-1β在OPCs發(fā)育中扮演的角色,我們進行OPCs的體外培養(yǎng),觀察IL-1β對OPCs增殖,凋亡及分化的影響,進一步探討IL-1p影響OPCs分化的可能機制。第一章LPS對胼胝體內(nèi)炎癥因子及其受體表達的影響目的：探討LPS是否影響胼胝體內(nèi)炎癥因子白介素-1β (Interleukin-1 beta, IL-1β)及其受體IL-1R1 (IL-1 receptor 1)的表達。方法：構(gòu)建膿毒癥新生幼鼠模型,使用新生1天的SD乳鼠,實驗組腹腔注射1mg/kg的LPS,對照組注射等體積的生理鹽水。與母鼠同籠共養(yǎng)至7d,取3h, 1d,3d,7d的時間點進行實驗,利用免疫熒光及免疫印跡和PCR的方法檢測IL-1p和IL-1R1的表達情況。選擇0.25mg/mg,0.5mg/kg,1mg/kg,2mg/kg,4mg/kg, 8mg/kg6種濃度梯度進行注射,然后進行7天存活率和體重的粗略估計,篩選出成活率最高的0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg,然后根據(jù)體重變化及1天,3天IL-1β和IL-1R1的表達情況,確定為lmg/kg最為適宜。在確定最佳LPS劑量后,驗證LPS是否增加炎癥因子IL-1β及其受體IL-1R1的表達,分為生理鹽水對照組及LPS組,取3h,1d,3d,7d幾個時間點,在進行相應(yīng)處理后利用免疫熒光,免疫印跡及PCR的方法檢測腦胼胝體內(nèi)IL-1β及IL-1R1的表達及定位情況。結(jié)果：等待孕鼠生產(chǎn),生仔約8-15只不等,將新生1d的SD乳鼠,體重約5-7g,分別注射LPS及生理鹽水,對照組處理1d后體重約7-9g,3d后約12-13g,7d后約18-20g,0.25mg/kg的LPS注射1d后體重為8-9g,3天后為12-13g,7d后為18-20g,與對照組無差別,棄去此劑量。0.5mg/kg LPS注射1d后體重為7-9g,3天后為11-13g,7d后為16-19g,與對照組差別不大,棄去此劑量。1mg/kgLPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率10%),3天后為8-10g(死亡率40%),7d后為12-13g,2mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率20%),3天后為8-10g(死亡率80%),7d后為12-13g,4mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率40%),3天后為8-10g(死亡率100%),7d無存活,8mg/kg LPS注射1d后體重為6-7.5g(死亡率80%),3天后為8-10g(死亡率100%),7d無存活,按模型的成功性及穩(wěn)定性選取lmg/kg LPS腹腔注射。根據(jù)上述篩選結(jié)果,后續(xù)免疫熒光、免疫蛋白印跡、PCR實驗發(fā)現(xiàn)lmg/kgLPS處理3h,1d,3d,7d后的胼胝體內(nèi)炎癥因子IL-1β及其受體IL-1R1表達較對照組明顯增加(P0.05)。結(jié)論：LPS可引起胼胝體內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活并釋放大量炎癥介質(zhì)IL-1p,在少突膠質(zhì)前體細胞(OPCs)上存在IL-1R1及受體表達增加。第二章膿毒癥模型對OPCs凋亡及增殖分化的影響目的：探討lmg/kg LPS注射后對OPCs凋亡和增殖及分化的影響。方法：利用雙標免疫熒光的方法探討膿毒癥模型對OPCs凋亡及增殖的影響。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取1d,3d,7d,14d,28d的胼胝體進行觀察。檢測Cleaved-Caspase-3(細胞凋亡標記物)和BrdU(細胞增殖標記物)的表達。利用雙標免疫熒光、WB及PCR的方法探討膿毒癥模型對OPCs分化的影響。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取7d,14d,28d的胼胝體進行觀察。檢測幼稚少突膠質(zhì)細胞標志物PDGFRa和NG2的的表達情況,檢測成熟少突膠質(zhì)細胞標志物MBP及CNPase的表達情況。檢測OPCs特異性因子Olig1以及Olig2的表達情況。結(jié)果：與對照組相比,OPCs在1d,3d,7d時凋亡細胞數(shù)增多而增殖細胞數(shù)降低,免疫熒光實驗及免疫蛋白印跡實驗表明PDGFRa和NG2在7d時較對照組減少,14d及28d時較對照組增多,而MBP及CNPase表達較對照組降低,7d,14d,28d胼胝體內(nèi)Olig1和Olig2表達量較對照組降低。結(jié)論：LPS所誘導的膿毒癥模型促進了早期OPCs的凋亡,抑制了早期OPCs的增殖及分化。第三章 膿毒癥模型對胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響目的：探討膿毒癥模型對胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響。方法：使用透射電鏡進行探究。將新生1d的SD乳鼠處理后,分為對照組及LPS組,與母鼠同籠共養(yǎng)至28d,取28d的胼胝體進行電鏡觀察。檢測胼胝體內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目及髓鞘的厚度。結(jié)果：與對照組相比,28d時LPS組胼胝體內(nèi)有髓神經(jīng)纖維的數(shù)目及髓鞘的厚度均降低(*P0.05)。結(jié)論：LPS誘導的膿毒癥模型可以導致軸突低髓鞘化。第四章 IL-1β對OPCs凋亡與增殖及分化的影響目的：探討IL-1β對OPCs凋亡及增殖及分化的影響。方法：取新生1天SD乳鼠的腦皮層進行混合細胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,然后分組后增殖1天,分為對照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra組(IL-1Ra,IL-1R的特異性拮抗劑)。進行免疫熒光檢測凋亡及增殖情況。取新生1天SD乳鼠的腦皮層進行混合細胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,然后消化后種相同數(shù)量的細胞分組培育,分為對照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra組(IL-1Ra,IL-1R的特異性拮抗劑)、30ng/ml IL-1Ra組。更換少突膠質(zhì)細胞分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)3天,各組處理3d后進行免疫熒光及免疫蛋白印跡檢測細胞分化情況。結(jié)果：三組凋亡無差別。IL-1β組增殖的OPCs數(shù)較對照組及IL-1β+IL-1Ra組減少。免疫熒光顯示與對照組相比,處理3d后IL-1β組幼稚的OPCs細胞數(shù)增多(NG2標記)。與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組幼稚的OPCs細胞數(shù)有所減少。與對照組相比,IL-1β組成熟的OPCs減少(MBP標記)。與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組成熟的OPCs較前增多。WB顯示與對照組相比,IL-1p組NG2、PDGFRa表達升高,而MBP、CNPase、Olig1、Olig2表達降低,與IL-1p組相比,IL-1β+IL-1Ra組NG2、PDGFRa表達有所降低,MBP、CNPase、Olig1、 Olig2表達有所回升,而IL-1Ra與對照組相比各項指標表達無差別。結(jié)論：IL-1β可抑制OPCs增殖及分化,但未對OPCs凋亡過程產(chǎn)生影響。第五章IL-1β對FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系目的：探討IL-1p對FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系。方法：(1)取新生1天SD乳鼠的腦皮層進行混合細胞培育,使用少突前體增殖培育基,增殖培育7天,增殖后,消化后種相同細胞數(shù),使用少突膠質(zhì)細胞分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)6h,各組處理6h后用WB法觀察磷酸化FYN,磷酸化MEK,磷酸化ERK表達。分為對照組(PBS組)、30ng/ml IL-1 β組、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra (IL-lRa,IL-1R的特異性拮抗劑)。(2)構(gòu)建ERK質(zhì)粒,進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,分為對照組(PBS組)、30ng/ml IL-1β組、ERK目的基因組、30ng/ml IL-1β+ERK目的基因組、空載體pEGFP組。此5組進行分化3d后進行免疫蛋白印跡檢測(Western blotting, WB)觀察NG2、PDGFRa、Olig1、Olig2、 MBP、CNPase表達情況。結(jié)果：(1)與對照組相比,處理6h后IL-1β組磷酸化-FY-N,磷酸化-MEK,磷酸化-ERK的表達有所降低。(2)與IL-1β組相比,IL-1β+IL-1Ra組磷酸化-FYN,磷酸化-MEK,磷酸化-ERK的表達有所回升。(3)與IL-1β組相比,IL-1β+ERK基因組幼稚標志物NG2、PDGFRα降低,成熟標志物MBP、CNPase、Olig1、 Olig2表達升高。結(jié)論：IL-1β可能通過抑制ERK通道來調(diào)控OPCs的分化。
【關(guān)鍵詞】：少突膠質(zhì)細胞 小膠質(zhì)細胞 LPS IL-1β FYN ERK
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R720.597
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-18
• 前言18-20
• 第一章 LPS對胼胝體內(nèi)炎癥因子及其受體表達的影響20-35
• 1. 實驗?zāi)康?/span>20
• 2. 實驗動物及材料20-22
• 2.1 實驗動物20
• 2.2 實驗材料20-21
• 2.3 試劑準備21-22
• 3. 實驗方法22-27
• 3.1 最佳模型制作22-23
• 3.2 LPS對腦胼胝體內(nèi)IL-1β及IL-1R_1表達的影響23-27
• 3.4 統(tǒng)計方法27
• 4. 實驗結(jié)果27-34
• 4.1 模型篩選結(jié)果27-28
• 4.2 LPS對腦胼胝體內(nèi)IL-1β表達的影響28-31
• 4.3 LPS對腦胼胝體內(nèi)IL-1R_1表達的影響31-34
• 5. 討論34
• 6. 結(jié)論34-35
• 第二章 膿毒癥模型對OPCs凋亡及增殖及分化的影響35-51
• 1. 實驗?zāi)康?/span>35
• 2. 實驗動物及材料35-36
• 2.1 實驗動物35
• 2.2 實驗材料35-36
• 3. 實驗方法36-40
• 3.1 探討LPS對胼胝體內(nèi)OPCs凋亡的影響36
• 3.2 探討LPS對胼胝體內(nèi)OPCs增殖的影響36
• 3.3 免疫熒光法檢測NG2、PDGFRα、MBP、CNPse的表達情況36-37
• 3.4 WB檢測LPS對腦胼胝體內(nèi)NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2的表達情況37-39
• 3.5 RT-PCR法檢測LPS對腦胼胝體Olig1、Olig2、Nkx2.2、Tcf4、Axin39-40
• 3.6 統(tǒng)計方法40
• 4. 實驗結(jié)果40-49
• 4.1 LPS注射后各時間點OPCs細胞的凋亡情況40-42
• 4.2 LPS注射后各時間點OPCs細胞的增殖情況42-43
• 4.3 免疫熒光檢測NG2、PDGFRα的表達43-46
• 4.4 MBP及CNPse的表達46-47
• 4.5 Olig1、Olig2、Nkx2.2、Tcf4、Axin2的表達47-49
• 5. 討論49-51
• 6. 結(jié)論51
• 第三章 膿毒癥模型對胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響51-55
• 1. 目的51
• 2. 實驗試劑及材料51-52
• 2.1 實驗動物51
• 2.2 實驗材料51-52
• 3. 實驗方法52-53
• 3.1 標本留取52
• 3.2 統(tǒng)計方法52-53
• 4. 實驗結(jié)果53-54
• 4.1 膿毒癥模型對胼胝體內(nèi)軸突髓鞘化的影響53-54
• 5. 討論54
• 6. 結(jié)論54-55
• 第四章 IL-1β對OPCs凋亡與增殖及分化的影響55-65
• 1. 實驗?zāi)康?/span>55
• 2. 實驗試劑及材料55-56
• 2.1 實驗動物55
• 2.2 實驗試劑55-56
• 3. 實驗方法56-59
• 3.1 OPCs細胞的獲取56-57
• 3.2 免疫熒光檢測OPCs的增殖與凋亡情況及細胞鑒定57
• 3.4 免疫熒光檢測OPCs的分化情況及細胞鑒定57-58
• 3.5 WB檢測NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2表達58-59
• 4. 實驗結(jié)果59-64
• 4.1 IL-1β對OPCs凋亡的影響60-61
• 4.2 IL-1β對OPCs增殖的影響61-62
• 4.3 免疫熒光檢測NG2及MBP的表達及細胞鑒定62-64
• 5. 討論64-65
• 6. 結(jié)論65
• 第五章 IL-1β對FYN-MEK-ERK通路的影響及兩者調(diào)控OPCs分化的關(guān)系65-73
• 1. 實驗?zāi)康?/span>65
• 2. 實驗試劑及材料65-66
• 3. 實驗方法66-69
• 3.1 OPCs細胞的獲取66-67
• 3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染67
• 3.3 WB檢測NG2、PDGFRα、MBP、CNPase、Olig1、Olig2、磷酸化FYN、磷酸化MEK、磷酸化ERK的表達67-69
• 4. 實驗結(jié)果69-71
• 4.1 IL-1β對FYN-MEK-ERK通路的影響69-70
• 4.2 IL-1β與ERK通道在調(diào)控OPCs分化中的關(guān)系70-71
• 5. 討論71-72
• 6. 結(jié)論72-73
• 全文總結(jié)73-74
• 參考文獻74-79
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文79-80
• 致謝80-81

【共引文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭星;巖茶提取物對實驗性大鼠視網(wǎng)膜光損傷保護及其機制的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：894912