本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p在體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)與作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 脂多糖 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 過(guò)表達(dá) 表達(dá)沉默 慢病毒 miR-223-3p IL6ST

【摘要】：第一部分mi R-223-3p在體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)研究目的:不同濃度、不同時(shí)間的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)體外刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),觀察LPS所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并初步探討mi R-223-3p與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)性。方法:LPS刺激濃度0ug/ml、1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用內(nèi)皮細(xì)胞4天、5天、6天后,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,并觀察記錄各濃度下細(xì)胞病變cytopathic effect,CPE㖞的結(jié)果;運(yùn)用Reed-Muench兩氏法檢測(cè)出半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(Tissue culture infective dose,TCID50);采用WST-1法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞活性、評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng);ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中炎癥分子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá);采用實(shí)時(shí)定量PCR方法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技術(shù)分別檢測(cè)mi R-223-3p在培養(yǎng)上清及內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果:1、LPS可致內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,LPS刺激濃度越高,光鏡下細(xì)胞發(fā)生病變?cè)絿?yán)重,可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng),細(xì)胞間隙增大,有不同程度疏松貼壁,胞漿內(nèi)顆粒減少,甚至部分細(xì)胞溶解、消失;LPS刺激濃度越高,WST-1檢測(cè)細(xì)胞吸光度值(OD值)越低,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),同一濃度LPS刺激組OD值呈降低趨勢(shì)(P0.0001)。2、ELISA法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著LPS刺激濃度的升高,培養(yǎng)上清中TNF-α表達(dá)水平逐漸升高,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);隨著LPS刺激濃度的升高,各LPS刺激組培養(yǎng)上清中IL-6水平較正常對(duì)照組均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),刺激組組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.6,P0.01),兩兩比較發(fā)現(xiàn),LPS 1ug/ml與LPS 20ug/ml、LPS 5ug/ml與LPS 10ug/ml兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LPS 5ug/ml與LPS 10ug/ml兩組培養(yǎng)上清中IL-6水平均高于LPS1ug/ml組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0001)。3、RT-q PCR檢測(cè)各LPS刺激組內(nèi)皮細(xì)胞中mi R-223-3p相對(duì)表達(dá)量較正常對(duì)照組升高明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但刺激組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義F=3.84,P=0.11)。在培養(yǎng)上清中mi R-223-3p相對(duì)無(wú)表達(dá)。結(jié)論:LPS對(duì)HUVEC損傷呈濃度與時(shí)間依賴性,隨著LPS刺激濃度的升高,TNF-α濃度逐漸升高;各實(shí)驗(yàn)組IL-6濃度均較正常對(duì)照組升高,但并不隨LPS刺激濃度的升高而增加。LPS刺激HUVEC構(gòu)建細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。LPS刺激HUVECs后,細(xì)胞內(nèi)mi R-223-3p表達(dá)水平上調(diào),與LPS刺激濃度無(wú)相關(guān)性。第二部分mi R-223-3p在體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中的作用機(jī)制研究目的:驗(yàn)證LPS刺激濃度與靶基因IL6ST的表達(dá)水平有無(wú)規(guī)律性;利用人工合成的LV-hsa-mi R-223-3p、LV-hsa-mi R-223-3p-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)一步驗(yàn)證mi R-223-3p過(guò)表達(dá)、表達(dá)沉默時(shí)對(duì)HUVEC生長(zhǎng)、上清中TNF-α、IL-6水平和細(xì)胞中靶基因IL6ST表達(dá)水平的影響。方法:RT-q PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度LPS刺激HUVEC中靶基因IL6ST的表達(dá)水平;病毒轉(zhuǎn)染部分實(shí)驗(yàn)分組為mi R-223-3p過(guò)表達(dá)組:mi R-223-3p過(guò)表達(dá)亞組(hsa-mi R-223-3p)、LPS刺激刺激濃度取TCID50值㖞+mi R-223-3p過(guò)表達(dá)組(簡(jiǎn)寫(xiě):LPS+mi R-223-3p);mi R-223-3p表達(dá)沉默組(hsa-mi R-223-3p inhibition);LPS刺激細(xì)胞組LPS刺激組,取TCID50值㖞、正常細(xì)胞組、空慢病毒對(duì)照組(LV-control)。RT-q PCR法檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL6ST的表達(dá)水平;倒置熒光顯微鏡觀察各組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的改變;WST-1法檢測(cè)細(xì)胞活性,ELISA檢測(cè)上清中TNF-α、IL-6濃度。結(jié)果:1、LPS刺激濃度為1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用內(nèi)皮細(xì)胞4天后,RT-q PCR檢測(cè)各LPS刺激組IL6ST表達(dá)量較正常對(duì)照組升高明顯,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但刺激組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.5,P=0.27)。2、慢病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h內(nèi)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上。3、病毒轉(zhuǎn)染部分結(jié)果:(1)hsa-mi R-223-3p組:hsa-mi R-223-3p組細(xì)胞內(nèi)IL6ST表達(dá)量較正常細(xì)胞組、LV-control組下調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),正常細(xì)胞組、LV-control組兩兩比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下hsa-mi R-223-3p組細(xì)胞、LV-control組與正常細(xì)胞組相比較,均表現(xiàn)為15%-20%細(xì)胞輪廓不飽滿,形態(tài)尚正常,細(xì)胞間隙無(wú)增寬,胞漿顆粒無(wú)減少,hsa-mi R-223-3p組細(xì)胞與LV-control組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異。WST-1檢測(cè)hsa-mi R-223-3p組、LV-control組OD值較正常細(xì)胞組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p組、LV-control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)hsa-mi R-223-3p組、LV-control組上清中TNF-α、IL-6水平較正常細(xì)胞組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p組、LV-control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)LPS+mi R-223-3p組:LPS+mi R-223-3p組細(xì)胞內(nèi)IL6ST表達(dá)水平較LPS刺激組下調(diào),LPS刺激組較病毒對(duì)照組上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下LPS+mi R-223-3p組細(xì)胞發(fā)生形態(tài)病變較LPS刺激組減輕,細(xì)胞皺縮數(shù)目減少,疏松貼壁程度減輕,未見(jiàn)大片細(xì)胞融合、溶解、消失。WST-1檢測(cè)LPS+mi R-223-3p組OD值較LPS刺激組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)LPS+mi R-223-3p組上清中TNF-α、IL-6水平較LPS刺激組降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),推測(cè)mi R-223-3p過(guò)表達(dá)后負(fù)向調(diào)控TNF-α、IL-6的表達(dá)。(3)hsa-mi R-223-3p inhibition組:hsa-mi R-223-3p inhibition組細(xì)胞內(nèi)IL6ST表達(dá)量較正常細(xì)胞對(duì)照組、LV-control組上調(diào),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下hsa-mi R-223-3p inhibition組與hsa-mi R-223-3p組、LV-control組細(xì)胞形態(tài)改變差異不明顯,可見(jiàn)約15%-20%細(xì)胞輪廓不飽滿,形態(tài)尚正常,細(xì)胞間隙無(wú)增寬,胞漿顆粒無(wú)減少。WST-1檢測(cè)hsa-mi R-223-3p inhibition組OD值較正常細(xì)胞組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p inhibition組、LV-control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測(cè)hsa-mi R-223-3p inhibition組上清中TNF-α、IL-6水平較正常細(xì)胞組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),hsa-mi R-223-3p inhibition組、LV-control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)hsa-mi R-223-3p組與hsa-mi R-223-3p inhibition組相比較,細(xì)胞內(nèi)IL6ST基因表達(dá)水平下調(diào)明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但熒光鏡下細(xì)胞形態(tài)差異不明顯,細(xì)胞活性、上清中TNF-α、IL-6水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、LPS刺激HUVECs后,IL6ST表達(dá)水平上調(diào),但不依賴于LPS刺激濃度。2、慢病毒轉(zhuǎn)染HUVECs效率達(dá)90%以上,但病毒轉(zhuǎn)染對(duì)HUVECs有一定程度的損傷作用。3、mi R-223-3p過(guò)表達(dá)可引起IL6ST基因表達(dá)下調(diào);mi R-223-3p表達(dá)沉默可導(dǎo)致IL6ST基因表達(dá)上調(diào)。在LPS損傷模型中,mi R-223-3p可能通過(guò)抑制IL6ST基因過(guò)度表達(dá)來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。4、mi R-223-3p過(guò)表達(dá)后負(fù)向調(diào)控TNF-α、IL-6的表達(dá),可減輕LPS刺激HUVECs造成的內(nèi)皮損傷。
【關(guān)鍵詞】：脂多糖 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 過(guò)表達(dá) 表達(dá)沉默 慢病毒 miR-223-3p IL6ST
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 研究背景14-18
• 參考文獻(xiàn)16-18
• 第一部分 MIR2233P在體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中的表達(dá)18-34
• 前言18
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 MIR2233P在體外內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中的作用機(jī)制研究34-56
• 前言34-35
• 材料與方法35-39
• 結(jié)果39-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 綜述56-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 中英文縮寫(xiě)68-69
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)課題和本課題的項(xiàng)目資助69-70
• 致謝70-71

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 米小軼，，宋繼謁;內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)組織型纖溶酶原激活物結(jié)合力的影響[J];中華病理學(xué)雜志;1995年03期

2 王保華,歐陽(yáng)靜萍,涂淑珍,魏蕾,劉永明,鄭漢巧,楊靜薇;當(dāng)歸抗高脂血清致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J];中國(guó)病理生理雜志;2000年10期

3 陳鐵鎮(zhèn);王兆元;劉寶宜;張寶庚;;動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)理的研究——內(nèi)皮細(xì)胞損傷與動(dòng)脈粥樣硬化[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;1987年07期

4 楊惠萍;不同劑量的抗凝血酶-Ⅲ對(duì)鼠內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血凝異常的影響[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);1999年04期

5 徐雅琴,張鈞華,柯楊,寧濤,馮莉雅,唐朝樞;氧化低密度脂蛋白內(nèi)皮受體在氧化低密度脂蛋白致內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用[J];中國(guó)病理生理雜志;2000年10期

6 宓寶斌,劉江華,文格波;氧化低密度脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)臨床研究;2005年09期

7 鄭運(yùn)江;俞國(guó)華;金孝\

本文編號(hào)：877676