本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p在體外內(nèi)皮細胞損傷中的表達與作用機制研究

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【摘要】：第一部分mi R-223-3p在體外內(nèi)皮細胞損傷中的表達研究目的:不同濃度、不同時間的脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)體外刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),觀察LPS所致內(nèi)皮細胞損傷,并初步探討mi R-223-3p與內(nèi)皮細胞損傷的相關(guān)性。方法:LPS刺激濃度0ug/ml、1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用內(nèi)皮細胞4天、5天、6天后,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變,并觀察記錄各濃度下細胞病變cytopathic effect,CPE㖞的結(jié)果;運用Reed-Muench兩氏法檢測出半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(Tissue culture infective dose,TCID50);采用WST-1法測定內(nèi)皮細胞活性、評價內(nèi)皮細胞生長;ELISA檢測培養(yǎng)上清中炎癥分子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)表達;采用實時定量PCR方法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技術(shù)分別檢測mi R-223-3p在培養(yǎng)上清及內(nèi)皮細胞中的表達水平。結(jié)果:1、LPS可致內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生改變,LPS刺激濃度越高,光鏡下細胞發(fā)生病變越嚴(yán)重,可見細胞形態(tài)拉長,細胞間隙增大,有不同程度疏松貼壁,胞漿內(nèi)顆粒減少,甚至部分細胞溶解、消失;LPS刺激濃度越高,WST-1檢測細胞吸光度值(OD值)越低,與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),隨著刺激時間的延長,同一濃度LPS刺激組OD值呈降低趨勢(P0.0001)。2、ELISA法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著LPS刺激濃度的升高,培養(yǎng)上清中TNF-α表達水平逐漸升高,與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);隨著LPS刺激濃度的升高,各LPS刺激組培養(yǎng)上清中IL-6水平較正常對照組均升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),刺激組組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=63.6,P0.01),兩兩比較發(fā)現(xiàn),LPS 1ug/ml與LPS 20ug/ml、LPS 5ug/ml與LPS 10ug/ml兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,LPS 5ug/ml與LPS 10ug/ml兩組培養(yǎng)上清中IL-6水平均高于LPS1ug/ml組,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.0001)。3、RT-q PCR檢測各LPS刺激組內(nèi)皮細胞中mi R-223-3p相對表達量較正常對照組升高明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但刺激組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義F=3.84,P=0.11)。在培養(yǎng)上清中mi R-223-3p相對無表達。結(jié)論:LPS對HUVEC損傷呈濃度與時間依賴性,隨著LPS刺激濃度的升高,TNF-α濃度逐漸升高;各實驗組IL-6濃度均較正常對照組升高,但并不隨LPS刺激濃度的升高而增加。LPS刺激HUVEC構(gòu)建細胞損傷模型構(gòu)建成功。LPS刺激HUVECs后,細胞內(nèi)mi R-223-3p表達水平上調(diào),與LPS刺激濃度無相關(guān)性。第二部分mi R-223-3p在體外內(nèi)皮細胞損傷模型中的作用機制研究目的:驗證LPS刺激濃度與靶基因IL6ST的表達水平有無規(guī)律性;利用人工合成的LV-hsa-mi R-223-3p、LV-hsa-mi R-223-3p-inhibition慢病毒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,進一步驗證mi R-223-3p過表達、表達沉默時對HUVEC生長、上清中TNF-α、IL-6水平和細胞中靶基因IL6ST表達水平的影響。方法:RT-q PCR技術(shù)檢測不同濃度LPS刺激HUVEC中靶基因IL6ST的表達水平;病毒轉(zhuǎn)染部分實驗分組為mi R-223-3p過表達組:mi R-223-3p過表達亞組(hsa-mi R-223-3p)、LPS刺激刺激濃度取TCID50值㖞+mi R-223-3p過表達組(簡寫:LPS+mi R-223-3p);mi R-223-3p表達沉默組(hsa-mi R-223-3p inhibition);LPS刺激細胞組LPS刺激組,取TCID50值㖞、正常細胞組、空慢病毒對照組(LV-control)。RT-q PCR法檢測各組內(nèi)皮細胞內(nèi)IL6ST的表達水平;倒置熒光顯微鏡觀察各組內(nèi)皮細胞形態(tài)的改變;WST-1法檢測細胞活性,ELISA檢測上清中TNF-α、IL-6濃度。結(jié)果:1、LPS刺激濃度為1ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml作用內(nèi)皮細胞4天后,RT-q PCR檢測各LPS刺激組IL6ST表達量較正常對照組升高明顯,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但刺激組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.5,P=0.27)。2、慢病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞24h內(nèi)轉(zhuǎn)染效率可達90%以上。3、病毒轉(zhuǎn)染部分結(jié)果:(1)hsa-mi R-223-3p組:hsa-mi R-223-3p組細胞內(nèi)IL6ST表達量較正常細胞組、LV-control組下調(diào),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),正常細胞組、LV-control組兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下hsa-mi R-223-3p組細胞、LV-control組與正常細胞組相比較,均表現(xiàn)為15%-20%細胞輪廓不飽滿,形態(tài)尚正常,細胞間隙無增寬,胞漿顆粒無減少,hsa-mi R-223-3p組細胞與LV-control組細胞形態(tài)無明顯差異。WST-1檢測hsa-mi R-223-3p組、LV-control組OD值較正常細胞組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p組、LV-control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測hsa-mi R-223-3p組、LV-control組上清中TNF-α、IL-6水平較正常細胞組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p組、LV-control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)LPS+mi R-223-3p組:LPS+mi R-223-3p組細胞內(nèi)IL6ST表達水平較LPS刺激組下調(diào),LPS刺激組較病毒對照組上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下LPS+mi R-223-3p組細胞發(fā)生形態(tài)病變較LPS刺激組減輕,細胞皺縮數(shù)目減少,疏松貼壁程度減輕,未見大片細胞融合、溶解、消失。WST-1檢測LPS+mi R-223-3p組OD值較LPS刺激組高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測LPS+mi R-223-3p組上清中TNF-α、IL-6水平較LPS刺激組降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),推測mi R-223-3p過表達后負向調(diào)控TNF-α、IL-6的表達。(3)hsa-mi R-223-3p inhibition組:hsa-mi R-223-3p inhibition組細胞內(nèi)IL6ST表達量較正常細胞對照組、LV-control組上調(diào),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。熒光鏡下hsa-mi R-223-3p inhibition組與hsa-mi R-223-3p組、LV-control組細胞形態(tài)改變差異不明顯,可見約15%-20%細胞輪廓不飽滿,形態(tài)尚正常,細胞間隙無增寬,胞漿顆粒無減少。WST-1檢測hsa-mi R-223-3p inhibition組OD值較正常細胞組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);hsa-mi R-223-3p inhibition組、LV-control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ELISA檢測hsa-mi R-223-3p inhibition組上清中TNF-α、IL-6水平較正常細胞組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),hsa-mi R-223-3p inhibition組、LV-control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)hsa-mi R-223-3p組與hsa-mi R-223-3p inhibition組相比較,細胞內(nèi)IL6ST基因表達水平下調(diào)明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但熒光鏡下細胞形態(tài)差異不明顯,細胞活性、上清中TNF-α、IL-6水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、LPS刺激HUVECs后,IL6ST表達水平上調(diào),但不依賴于LPS刺激濃度。2、慢病毒轉(zhuǎn)染HUVECs效率達90%以上,但病毒轉(zhuǎn)染對HUVECs有一定程度的損傷作用。3、mi R-223-3p過表達可引起IL6ST基因表達下調(diào);mi R-223-3p表達沉默可導(dǎo)致IL6ST基因表達上調(diào)。在LPS損傷模型中,mi R-223-3p可能通過抑制IL6ST基因過度表達來發(fā)揮保護作用。4、mi R-223-3p過表達后負向調(diào)控TNF-α、IL-6的表達,可減輕LPS刺激HUVECs造成的內(nèi)皮損傷。
【關(guān)鍵詞】：脂多糖 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 過表達 表達沉默 慢病毒 miR-223-3p IL6ST
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 研究背景14-18
• 參考文獻16-18
• 第一部分 MIR2233P在體外內(nèi)皮細胞損傷模型中的表達18-34
• 前言18
• 材料與方法18-24
• 結(jié)果24-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻32-34
• 第二部分 MIR2233P在體外內(nèi)皮細胞損傷模型中的作用機制研究34-56
• 前言34-35
• 材料與方法35-39
• 結(jié)果39-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53
• 參考文獻53-56
• 綜述56-68
• 參考文獻63-68
• 中英文縮寫68-69
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)課題和本課題的項目資助69-70
• 致謝70-71

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本文編號：877676