本文關(guān)鍵詞：金欣口服液對RSV活化誘導(dǎo)的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 金欣口服液 呼吸道合胞病毒 TLR4 TAK1 信號傳導(dǎo)通路 小干擾RNA

【摘要】：呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是世界范圍內(nèi)嬰幼兒最重要的病毒性下呼吸道感染病毒病原,目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無特效的抗RSV藥物,相關(guān)疫苗的開發(fā)也尚未成熟。Delgado, M. F.等2009年在《Nat Med》中提出,滅活的RSV疫苗是確保嬰幼兒接種疫苗安全性的關(guān)鍵因素,因其通過Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的刺激可增強(qiáng)保護(hù)性抗原表位的抗體親和力。TLRs作為重要的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)類型,在RSV感染過程中發(fā)揮著重要的作用,它能識別出不同微生物的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecule pattern, PAMP),是研究RSV感染的新的方向。中醫(yī)藥以辨證論治及整體觀念為基礎(chǔ),提出清肺、化痰、止咳等一系列具有中醫(yī)特色的抗RSV感染的方法,并取得良好的臨床療效,導(dǎo)師汪受傳教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊承擔(dān)的國家自然科學(xué)基金項目“金欣口服液對RSV活化的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制研究(81072840)”,前期研究成果已證實金欣口服液能夠調(diào)控RSV感染活化誘導(dǎo)的TLR3(sTLR3)、TLR7(sTLR7)及部分TLR4(sTLR4)下游信號分子的表達(dá)水平。金欣口服液有明顯抑制RSV的作用,病毒的F蛋白或其受體可能是其作用位點；這些研究結(jié)果為治療嬰幼兒RSV肺炎提供了新的思路。 鑒于中醫(yī)藥的多靶點作用,本實驗從TLR4及其介導(dǎo)的信號通路入手,采用RNA干擾(RNAi)技術(shù),探討金欣口服液抗對RSV誘導(dǎo)的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控,及與其它TLRs的相關(guān)性。1目的 研究金欣口服液對RSV誘導(dǎo)的TLR4信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用,并從微觀角度探討金欣口服液治療RSV肺炎的免疫學(xué)機(jī)制。2方法 體外實驗：采用金欣口服液含藥血清進(jìn)行干預(yù)體外培養(yǎng)的受RSV感染的RAW264.7細(xì)胞,24h后收集細(xì)胞,并用TLR4siRNA干擾后檢測TLR4及轉(zhuǎn)化生長因子p活化激酶(TAK1)相關(guān)指標(biāo),觀察轉(zhuǎn)染后的金欣口服液對RAW264.7細(xì)胞TLR4mRNA、TAK1mRNA水平及蛋白表達(dá)的影響,觀察金欣口服液對RSV誘導(dǎo)的TLR4傳導(dǎo)通路影響及與其它TLRs信號通路的相關(guān)性。 體內(nèi)實驗：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液進(jìn)行干預(yù),并于首次滴鼻后24小時,取小鼠肺組織,行病理組織切片以評價肺部病變情況,并運(yùn)用Western Blot法檢測小鼠肺組織TLR4, TAK1蛋白表達(dá)情況。3結(jié)果 3.1體外實驗 3.1.1TLR4siRNA轉(zhuǎn)染后 (1)TLR4siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞干擾了TLR4的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后,TLR4mRNA的表達(dá)下降了0.456倍,表明用TLR4siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞千擾TLR4mRNA的生成模型復(fù)制是成功的。RSV組TLR4mRNA的表達(dá)較正常組下調(diào)明顯,金欣口服液組與RSV組相比TLR4mRNA的表達(dá)有所上升(ΔP0.05),故金欣口服液含藥血清可上調(diào)RSV誘導(dǎo)的TLR4mRNA的表達(dá)。 (2)TLR4siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后,可見TAK1mRNA的表達(dá)有所下調(diào),RSV感染后,TAK1mRNA的表達(dá)下降了0.632倍,與轉(zhuǎn)染組相比利巴韋林與金欣含藥血清均可上調(diào)TAK1mRNA的表達(dá)(▲▲P0.01),金欣口服液組和利巴韋林組與RSV組相比表達(dá)有所上升( P0.01),且金欣口服液上升更明顯。 (3)使用TLR4siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞干擾了TLR4的表達(dá),轉(zhuǎn)染后,可見TLR4蛋白表達(dá)明顯下調(diào),RSV組與TLR4siRNA轉(zhuǎn)染組相比蛋白表達(dá)存在差異(P0.01)。與轉(zhuǎn)染組相比利巴韋林注射液、金欣含藥血清均可上調(diào)TLR4蛋白的表達(dá),且金欣口服液的上調(diào)較利巴韋林明顯(P0.05) (4)轉(zhuǎn)染后,RSV感染RAW264.7細(xì)胞可見TAK1蛋白存在明顯的改變,轉(zhuǎn)染組較正常組有明顯下調(diào)(P0.01),RSV感染組較轉(zhuǎn)染組有所下調(diào)(P0.01)。利巴韋林、金欣含藥血清可下調(diào)TAK1蛋白的表達(dá)(P0.01),但利巴韋林組下調(diào)更加明顯,兩者之間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.2體內(nèi)試驗 3.2.1RSV感染24小時后BALB/c小鼠肺臟病理結(jié)果顯示金欣口服液組肺內(nèi)炎癥均有不同程度減輕,病理評分結(jié)果顯示治療組各時間點與RSV感染組相比均有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P0.05)。 3.2.2金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織TLR4、TAK1表達(dá)的影響：RSV感染24h后,TLR4、TAK1蛋白的表達(dá)與正常照相比明顯升高(P0.01),而與RSV感染組相比,金欣口服液則能降低RSV感染后TLR4、TAK1蛋白表達(dá)水平(P0.05),效果優(yōu)于利巴韋林組(P0.01),同時根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.980、P=0.0000.01,我們可以認(rèn)為TLR4與TAK1的蛋白表達(dá)呈正向直線相關(guān)。4結(jié)論 4.1金欣口服液對減輕RSV感染小鼠的肺部炎癥具有明顯效果,并且在疾病早期其作用略優(yōu)于利巴韋林。 4.2金欣口服液能抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TLR4/TAK1蛋白的表達(dá),而TLR4的蛋白表達(dá)與TAK1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān),二者呈平行抑制關(guān)系,也就是說金欣口服液發(fā)揮抗RSV作用機(jī)制中的TLR4信號通路途徑可能是通過TAK1來發(fā)揮作用的 4.3TLR4siRNA轉(zhuǎn)染后,TLR4mRNA及蛋白表達(dá)明顯受抑,TAK1mRNA及蛋白表達(dá)也明顯受抑,表明TAK1的表達(dá)受TLR4調(diào)控,同時轉(zhuǎn)染后金欣口服液組TLR4mRNA及蛋白表達(dá)有所上調(diào),證明了其它信號通路可能對TLR4通路也存在一定的影響,TAK1通路并非是TLR4信號通路的唯一途徑。 4.4金欣口服液發(fā)揮抗RSV作用機(jī)制中的TLR4信號通路途徑可能是通過TAK1來發(fā)揮作用的,即TLR4/MyD88/TAKl/NF-κB/TNF-α途徑。
【關(guān)鍵詞】：金欣口服液 呼吸道合胞病毒 TLR4 TAK1 信號傳導(dǎo)通路 小干擾RNA
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R272
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 第一部分 理論研究15-26
• 1 中醫(yī)學(xué)對RSV肺炎的相關(guān)認(rèn)識15-19
• 1.1 歷史沿革15-16
• 1.2 小兒肺炎喘嗽的病因病機(jī)概述16-17
• 1.3 辨證分型17
• 1.4 現(xiàn)代中醫(yī)藥治療RSV肺炎的研究17-19
• 2 西醫(yī)學(xué)對RSV肺炎的認(rèn)識19-23
• 2.1 RSV及TLR3、TLR4的化學(xué)生物學(xué)特性及其信號通路19-23
• 3 金欣口服液的前期實驗研究成果23-24
• 4 研究思路24-26
• 第二部分 體外實驗研究26-40
• 1 實驗材料26-29
• 1.1 實驗細(xì)胞26
• 1.2 實驗動物26
• 1.3 實驗病毒26
• 1.4 實驗藥物26
• 1.5 實驗試劑26-27
• 1.6 實驗儀器及設(shè)備27-28
• 1.7 溶液的配制28-29
• 2 實驗方法29-34
• 2.1 Hep-2細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)29
• 2.2 金欣口服液及其含藥血清的制備29
• 2.3 MTT法測定藥物最大無毒濃度檢測步驟29-30
• 2.4 RSV感染RAW264.7細(xì)胞模型的制備30
• 2.5 實驗分組、給藥方案及標(biāo)本的采集30
• 2.6 TLR4 siRNA干擾實驗30-31
• 2.7 實時熒光定量PCR法檢測TLR4、TAK1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平31-32
• 2.8 免疫印跡法(Western blot)具體步驟32-34
• 3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計34-35
• 4 結(jié)果35-40
• 4.1 利巴韋林對RAW264.7、金欣口服液含藥血清細(xì)胞最大無毒濃度測定結(jié)果35-36
• 4.2 金欣口服液對轉(zhuǎn)染后RAW264.7細(xì)胞TLR4、TAK1 mRNA表達(dá)的影響36-38
• 4.3 轉(zhuǎn)染后金欣口服液對RAW264.7細(xì)胞TLR4、TAK1、蛋白表達(dá)的影響38-40
• 第三部分 體內(nèi)實驗研究40-43
• 1 實驗材料40
• 1.1 實驗病毒40
• 1.2 實驗動物40
• 1.3 實驗用金欣口服液40
• 1.4 實驗試劑40
• 1.5 實驗儀器及設(shè)備40
• 1.6 溶液的配制40
• 2 實驗方法40-41
• 2.1 RSV感染BALB/c小鼠肺炎模型的制備及分組40-41
• 2.2 Western Blot法檢測BALB/c小鼠肺組織TLR4、TAK1蛋白表達(dá)41
• 2.3 肺組織病理評價金欣口服液干預(yù)后RSV感染BALB/c小鼠肺組織病變情況41
• 3 統(tǒng)計方法41
• 4 結(jié)果41-43
• 4.1 金欣口服液對RSV感染BALB/c小鼠肺組織TLR4、TAK1表達(dá)的影響41-42
• 4.2 RSV感染24小時后病理讀片結(jié)果(見附圖3-2)42-43
• 第四部分 討論43-46
• 第五部分 結(jié)語46-48
• 1 結(jié)論46
• 2 創(chuàng)新之處46
• 3 問題與展望46-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 附圖53-54
• 英文~.略詞表54-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文與撰寫學(xué)術(shù)著作56-57
• 致謝57-58
• 個人簡歷58

【參考文獻(xiàn)】

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1 李佳曦;金欣口服液及白藜蘆醇對RSV活化誘導(dǎo)的TLR3及其信號通路的調(diào)控作用[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2012年

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本文編號：851592