發(fā)布時(shí)間：2017-09-14 01:50

  本文關(guān)鍵詞：RXRA在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中的作用機(jī)制初步研究

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【摘要】：心臟圓錐動(dòng)脈干畸形是一類導(dǎo)致紫紺和低氧血癥的復(fù)雜先天性心臟病,包括法洛四聯(lián)癥(TOF)、肺動(dòng)脈閉鎖、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動(dòng)脈干等多種表型。圓錐動(dòng)脈干畸形的共同病因被認(rèn)為是流出道的發(fā)育障礙。法洛四聯(lián)癥是最主要的圓錐動(dòng)脈干畸形,主要表現(xiàn)為右室流出道部分的發(fā)育異常、主動(dòng)脈騎跨,室間隔缺損和右室肥厚,是造成我國(guó)嬰兒和新生兒死亡最主要的原因之一,因此研究其發(fā)病機(jī)制,對(duì)于開展產(chǎn)前篩查、預(yù)防和干預(yù)具有重要意義。 類視黃酸受體alpha(RXRA)是視黃酸(RA)信號(hào)通路中的重要受體,RA信號(hào)通路已被證實(shí)在心臟發(fā)育的多個(gè)環(huán)節(jié)包括流出道的發(fā)育發(fā)揮重要作用,提示RXRA在心臟發(fā)育過(guò)程中的重要作用。此外,RXRA基因敲除小鼠(Rxr α-/-)可出現(xiàn)圓錐動(dòng)脈干畸形表現(xiàn)。據(jù)此推測(cè),RXRA可能是TOF的候選致病基因。但目前并未見先天性心臟病患者中RXRA的相關(guān)研究,缺乏有力的人群研究證據(jù)。 作為哺乳動(dòng)物心臟中最主要的間隙連接蛋白,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已顯示Connexin43(Cx43)可能是圓錐動(dòng)脈干畸形遺傳易感性的候選基因。本課題組前期在中國(guó)法洛四聯(lián)癥患者人群中對(duì)Cx43基因進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)法洛四聯(lián)癥患者中Cx43存在異常高表達(dá)。其異常分布和高表達(dá)可能影響了心臟發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移以及一些重要信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致右室流出道梗阻等表型異常。但是法洛四聯(lián)癥患者中Cx43異常高表達(dá)的原因尚不明確。 本研究通過(guò)檢測(cè)法洛四聯(lián)癥患兒的RXRA基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列、右室流出道心肌組織中RXRA蛋白和mRNA的表達(dá)水平及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,探討人類法洛四聯(lián)癥與候選易感基因RXRA的關(guān)系,并且通過(guò)初步探討RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中存在的蛋白作用分子機(jī)制,闡明RXRA基因究竟在哪些環(huán)節(jié)上參與法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制。 第一部分法洛四聯(lián)癥患兒RXRA基因編碼區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)序列分析 目的： 對(duì)中國(guó)TOF患兒中RXRA基因編碼區(qū)及啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析,探討RXRA基因變異與TOF的關(guān)系。 方法： 收集TOF患兒外周血213例及年齡和性別與病例組盡量匹配的健康兒童外周血500例,提取基因組DNA, PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄RXRA編碼區(qū)序列、外顯子內(nèi)含子連接處及啟動(dòng)子區(qū)序列,進(jìn)行測(cè)序。對(duì)RXRA基因序列變化與TOF的關(guān)系進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.外顯子2及外顯子3各發(fā)現(xiàn)一個(gè)未報(bào)道的SNP:C.237G/A和c.288A/G。c.237G/A和c.288A/G位點(diǎn)堿基改變未導(dǎo)致氨基酸改變,且基因型頻率和等位基因頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 2.在TOF組RXRA基因外顯子內(nèi)含子連接處共發(fā)現(xiàn)兩個(gè)雜合突變,分別為第四外顯子上游5bp處的c.431-5C/T和第八外顯子下游1lbp處c.1135+11C/G。上訴兩個(gè)突變?cè)趦砂倮和形礄z測(cè)到。 3.在TOF組RXRA基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)上游1191bp處檢測(cè)出一個(gè)雜合突變,即-1191A/G (TSS定為+1)。該突變?cè)谖灏倮和形礄z測(cè)到。在TSS上游1287bp處檢測(cè)出一個(gè)雜合突變,即-1287C/T。該突變?cè)谖灏倮和袡z測(cè)到一例。此外,共檢測(cè)出兩個(gè)新發(fā)SNP,即-800C/A及-760C/T。上訴兩個(gè)SNP基因型頻率和等位基因頻率在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)這四個(gè)位點(diǎn)及其附近有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 小結(jié)： 1.TOF患兒RXRA基因編碼區(qū)突變少見。 2.TOF患兒RXRA基因啟動(dòng)子區(qū)序列變化可能通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響RXRA表達(dá)水平從而導(dǎo)致TOF的發(fā)生。 第二部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織RXRA基因的表達(dá)研究 目的： 檢測(cè)TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因mRNA和蛋白水平表達(dá)情況,探討其表達(dá)異常在TOF發(fā)病中的作用。 方法： 選取30例TOF患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象,以10例非心源性死亡右室流出道心肌組織為對(duì)照,分別應(yīng)用Real-time PCR和免疫組化檢測(cè)TOF患者和對(duì)照組心肌組織中RXRA基因mRNA及蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1. Real-time PCR提示TOF病例組心肌組織中RXRA基因mRNA水平較正常對(duì)照組減低。 2.免疫組化結(jié)果提示TOF病例組心肌組織中RXRA蛋白水平同樣較正常對(duì)照組減低。 小結(jié)： TOF患兒可能存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控異常,導(dǎo)致RXRA mRNA和蛋白水平表達(dá)均降低。 第三部分法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究 目的： 檢測(cè)TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平,從轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制探討TOF患兒RXRA基因表達(dá)降低的原因及其參與TOF發(fā)病的環(huán)節(jié)。 方法： 選取26例TOF患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象,以6例與之年齡和性別相匹配的非心源性死亡兒童右室流出道心肌組織為對(duì)照,應(yīng)用BSP技術(shù)檢測(cè)TOF患兒右室流出道心肌組織中RXRA基因啟動(dòng)子甲基化水平,同時(shí)應(yīng)用Luciferase報(bào)告基因驗(yàn)證有差異的甲基化位點(diǎn)的功能。 結(jié)果： 1.TOF患兒RXRA啟動(dòng)子區(qū)-1000至-1453區(qū)域整體甲基化水平較對(duì)照組增高。 2.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)RXRA啟動(dòng)子區(qū)-1000至-1453區(qū)域具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包括Spl結(jié)合位點(diǎn)。 3.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RXRA啟動(dòng)子區(qū)-1000至-1453區(qū)域具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的作用。對(duì)PGL3-RXRA-promoter報(bào)告基因載體進(jìn)行體外甲基化后再轉(zhuǎn)染,結(jié)果提示其轉(zhuǎn)錄水平較未甲基化者降低。 小結(jié)： RXRA啟動(dòng)子區(qū)-1000至-1453區(qū)域包含多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件,具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的作用。TOF患者該區(qū)域DNA甲基化水平增高可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低。 第四部分法洛四聯(lián)癥患者中RXRA蛋白和Cx43蛋白的相關(guān)機(jī)制研究 目的： 初步探討RXRA蛋白和Cx43蛋白在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中存在的蛋白作用分子機(jī)制。 方法： 構(gòu)建人類RXRA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)載體,體外共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,利用western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)RXRA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)變化情況,同時(shí)利用Real-time PCR檢測(cè)RXRA及Cx43mRNA表達(dá)變化情況；利用9-cis RA處理HEK293T細(xì)胞,增加其內(nèi)源性RXRA的表達(dá),同時(shí)利用western blot檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)變化情況；構(gòu)建RXRA mRNA表達(dá)干擾質(zhì)粒,內(nèi)源性降低RXRA的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)Cx43蛋白表達(dá)變化情況。 結(jié)果： 1.體外共轉(zhuǎn)染RXRA蛋白和Cx43蛋白表達(dá)載體,western blot和免疫熒光均提示RXRA蛋白會(huì)抑制Cx43蛋白表達(dá),而Real-time PCR提示RXRA蛋白對(duì)Cx43蛋白表達(dá)的抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平 2.9-cis RA處理HEK293T細(xì)胞后,Cx43蛋白表達(dá)較未處理者降低； 3.利用干擾質(zhì)粒抑制RXRA的表達(dá)后,檢測(cè)結(jié)果示Cx43蛋白表達(dá)增加。 小結(jié)： RXRA可能抑制Cx43mRNA及蛋白的表達(dá),TOF患者中RXRA表達(dá)水平降低,可能使其對(duì)Cx43的表達(dá)抑制作用減弱,導(dǎo)致Cx43異常高表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：圓錐動(dòng)脈干畸形 法洛四聯(lián)癥 RXRA Cx43單核酸多態(tài)性 甲基化 啟動(dòng)子 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R725.4
【目錄】：

• 目錄3-4
• 縮略詞4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 引言13-15
• 第一部分 法洛四聯(lián)癥患兒RXRA基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)DNA序列分析15-33
• 前言15
• 資料和方法15-23
• 結(jié)果23-31
• 第一部分討論31-32
• 第一部分小結(jié)32-33
• 第二部分 法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織RXRA基因的表達(dá)研究33-42
• 前言33
• 資料與方法33-38
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 第二部分討論41
• 第二部分小結(jié)41-42
• 第三部分 法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織RXRA基因表達(dá)調(diào)控研究42-61
• 前言42
• 資料和方法42-54
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-59
• 第三部分討論59-60
• 第三部分小結(jié)60-61
• 第四部分 法洛四聯(lián)癥患兒中RXRA蛋白和Cx43蛋白的相關(guān)機(jī)制研究61-74
• 前言61
• 資料和方法61-67
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-72
• 第四部分討論72-73
• 第四部分小結(jié)73-74
• 全文總結(jié)及創(chuàng)新性、局限性、展望74-75
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 綜述80-91
• 參考文獻(xiàn)85-91
• 致謝91-92
• 研究生期間文章發(fā)表及獎(jiǎng)勵(lì)92-93
• 參加學(xué)術(shù)會(huì)議93-94

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：847173