本文關(guān)鍵詞：新生鼠缺氧缺血性腦損傷后自噬水平及其變化對細(xì)胞凋亡影響的初步研究

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【摘要】：研究目的及意義： 自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程,是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)主要降解短半衰期蛋白質(zhì),相對于其而言,細(xì)胞的自噬被認(rèn)為是大多數(shù)長半衰期蛋白質(zhì)和細(xì)胞器通過溶酶體降解和再循環(huán)一種途徑,對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞生存至關(guān)重要。在應(yīng)激條件如饑餓、低氧、大腦局部缺血下,可誘導(dǎo)自噬的表達(dá)增加,提示自噬可能是一種細(xì)胞自身的重要生存機(jī)制。 近十年,隨著酵母模型的成功建立和基因技術(shù)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)了4組酵母自噬相關(guān)基因atg (Autophagy-related gene, ATG),它們的編碼蛋白在自噬的誘導(dǎo)、發(fā)生、成熟、再循環(huán)中起著重要作用。其中Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class Ⅲ PI3K)復(fù)合物(Atg6-Atg14-Vps15-ClassⅢ PI3K)磷酸化磷脂酰肌醇(PI)為3-磷脂酰肌醇(P13P),募集胞漿中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質(zhì),用于自噬體膜的形成。已發(fā)現(xiàn)自噬的分子機(jī)制在高等真核生物中與酵母類似,具有保守性。目前已經(jīng)在酵母中發(fā)現(xiàn)30個不同自噬相關(guān)基因(ATG),其中大部分在哺乳動物中具有同源性,對這些基因產(chǎn)物進(jìn)行分析,有利于發(fā)現(xiàn)自噬的機(jī)制及其作用。Beclin1是酵母自噬基因6(Apg6/Vps30)在哺乳動物的同源物,和抗凋亡基因Bcl-2相互作用,可能參與自噬與凋亡的啟動機(jī)制,對細(xì)胞生存和死亡有重要意義。自噬的信號調(diào)控機(jī)制主要有：(1)依賴nTOR (marmmalian targetof rapamycin)通路；(2)P13K通路；(3)其他蛋白通路。 泛素蛋白酶體系途徑和自噬溶酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的兩條主要途徑。蛋白酶體抑制劑乳胞素能夠?qū)е翪57BL/6型鼠PC12細(xì)胞泛素蛋白酶體功能障礙,雷帕霉素能夠減少乳胞素誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡和泛素化蛋白聚集,顯著減輕黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞丟失和紋狀體多巴胺神經(jīng)細(xì)胞減少,而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤能夠阻斷這種保護(hù)作用。另外,雷帕霉素能夠升高Bcl-2的水平并且阻斷細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。神經(jīng)退行性疾病的相同點(diǎn)是異常蛋白在細(xì)胞內(nèi)蓄積,例如與亨廷頓病(Huntington's disease, HD)發(fā)病相關(guān)的亨廷頓蛋白(Huntington, Htt)、帕金森病發(fā)病相關(guān)的a-突觸核蛋白等,而這些蛋白主要是依賴自噬途徑被降解。對亨廷頓病的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠提高亨廷頓蛋白的清除能力,減少亨廷頓蛋白的蓄積及其毒性。在果蠅的亨廷頓病模型中雷帕霉素能夠阻止神經(jīng)的退行性變；在轉(zhuǎn)基因亨廷頓病小鼠模型中雷帕霉素的同源物細(xì)胞周期抑制劑-779能夠改善與HD相關(guān)的行為表現(xiàn)并能夠降低異常蛋白聚集物。這些已經(jīng)在細(xì)胞模型、斑馬魚和老鼠模型中得到了證明。Wang等的研究表明線粒體自噬(mitophagy)對神經(jīng)細(xì)胞的生存具有保護(hù)作用,褪黑素可能通過誘導(dǎo)自噬來清除受損的線粒體,這可能是褪黑素抗缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。自噬維持心臟正常功能發(fā)揮重要作用。在缺乏ATG5小鼠,出生后死于心臟高水平的自由氨基酸ATG和能量消耗。成年小鼠在心臟誘導(dǎo)敲除ATG5引起心肌肥大,左心室擴(kuò)張和收縮功能障礙,同時伴隨泛素蛋白增加和線粒體集合。還有一些研究表明自噬與感染性疾病、克羅恩病、寄生蟲病、2型糖尿病等一系列疾病有關(guān)。 自噬在疾病中的作用日益被人們重視,目前,國內(nèi)對自噬在缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)中的作用及其機(jī)制相關(guān)研究甚少。而新生兒缺氧缺血性腦損傷至今仍是造成圍產(chǎn)期新生兒死亡和兒童傷殘的主要原因之一,可致多個器官系統(tǒng)損害,其中受損最重的是神經(jīng)系統(tǒng),將遺留諸多后遺癥,如腦性癱瘓、智力低下、癲癇及發(fā)育遲緩等。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的建立和搶救技術(shù)的提高,許多中、重度缺氧缺血性腦損傷患兒得以生存,但存活兒永久性腦功能障礙發(fā)病率仍較高。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國每年活產(chǎn)嬰1800萬-2000萬,窒息發(fā)生率為13.6%。在窒息患兒中,不同程度傷殘者的發(fā)生率為15.6%,每年新增30萬殘疾兒童。重度窒息有60%-80%發(fā)生HIBD,其病死率高,神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率約為30%-40%。目前,臨床上對新生兒缺氧缺血性腦損傷的治療多采用對癥處理、營養(yǎng)支持、腦神經(jīng)營養(yǎng)因子及早期干預(yù)等綜合治療,尚缺乏特效、經(jīng)濟(jì)的方法。因此,深入探討HIBD損傷機(jī)制及其修復(fù)機(jī)制,為尋找新的治療措施提供理論支持,對提高新生兒HIBD存活率,減少存活兒遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,提高我國人口質(zhì)量有深遠(yuǎn)意義。 本實(shí)驗(yàn)通過研究自噬相關(guān)蛋白Beclin1在新生鼠缺氧缺血性腦損傷后是否在海馬及皮層組織表達(dá),觀察其水平時間依賴性的動態(tài)變化。應(yīng)用自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(rapamycin)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)改變?nèi)毖跞毖阅X損傷后自噬表達(dá)水平,觀察Caspase-3蛋白在海馬及皮層組織的陽性表達(dá),比較各組各時間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)差異。從超微結(jié)構(gòu)、分子水平上證實(shí)自噬的表達(dá)及其水平變化,對比各組不同時間點(diǎn)Caspase-3的表達(dá)差異,探討自噬影響缺氧缺血性腦損傷的可能機(jī)制,為臨床治療缺氧缺血性腦損傷尋找新的治療靶點(diǎn)提供新理論。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.實(shí)驗(yàn)分組及HIBD大鼠模型制作 清潔級7日齡SD大鼠303只,體重16-20g。其中216只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、雷帕霉素組及3-甲基腺嘌呤組2h、4h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h等9個時間點(diǎn),每組54只。結(jié)扎左頸總動脈和混合氣體(92%氮?dú)夂?%氧氣,1L/min)中缺氧2h制成HIBD模型。干預(yù)組在HIBD模型成功后0.5h進(jìn)行腹腔注射一次,劑量分別為3-甲基腺嘌呤100nmol/μL,21μL和雷帕霉素1.0mg/kg。假手術(shù)組僅分離左頸總動脈,不進(jìn)行缺氧處理。剩余78只大鼠,54只隨機(jī)分為假手術(shù)組及模型組,在9個時間點(diǎn)取海馬及皮層組織進(jìn)行westernblot檢測；24只分上述四組,24h時取海馬及皮層組織進(jìn)行western blot檢測；9只為模型組,2h、4h、24h取海馬組織行透射電鏡檢測。 2.石蠟組織包埋及切片 108只大鼠乙醚麻醉后,冰面上迅速斷頸去顱骨,取厚度約3mm的海馬冠狀斷面腦組織,迅速投入4%多聚甲醛固定液中于4℃下固定2天。固定好的腦組織按照常規(guī)石蠟標(biāo)本包埋方法進(jìn)行制作石蠟標(biāo)本,石蠟組織切片機(jī)切片,切片厚度5μm。 3.HE染色 石蠟切片脫蠟水合后,經(jīng)蘇木素染色3min,1%伊紅染色2min,中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。 4.電鏡檢測 透射電鏡檢測模型組2h、4h、24h海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化,觀察線粒體及自噬體形態(tài)變化。 5.免疫熒光 免疫熒光檢測各組Beclin1蛋白的分布與表達(dá)的變化,用熒光顯微鏡觀察Beclin1各組的表達(dá)變化。 6.Western blot Western blot檢測模型組和假手術(shù)組Beclin1表達(dá),觀察不同時間點(diǎn)Beclin1水平變化；及觀察應(yīng)用藥物后Beclin1水平變化。 7.免疫組化 免疫組化檢測HIBD后Caspase-3及突觸素表達(dá)變化。石蠟切片抗原修復(fù)采用微波爐抗原熱修復(fù),抗原修復(fù)液為檸檬酸緩沖液(0.01mol.L-1, PH6),微波爐加熱至煮沸后斷電,反復(fù)三次,間隔7min。DAB顯色,中性樹膠封片、晾干后在顯微鏡下觀察、分析。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組間比較采用ONE-WAY方差分析,方差齊性時多重比較用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時多重比較用Dunnett'T3檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、通過HE染色觀察假手術(shù)組與模型組腦組織病理改變,假手術(shù)組左側(cè)海馬及皮層組織厚而飽滿,神經(jīng)元排列整齊、有序,結(jié)構(gòu)未見明顯異常；模型組左側(cè)海馬及皮層組織神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,部分神經(jīng)細(xì)胞變性壞死,細(xì)胞周隙增寬,失去正常結(jié)構(gòu)層次。 2、腦缺氧缺血性損傷2h大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞核膜完整,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,胞質(zhì)中線粒體形態(tài)分布正常,線粒體嵴清晰；4h線粒體腫脹,位于細(xì)胞核旁線粒體腫脹,線粒體嵴斷裂、結(jié)構(gòu)模糊；24h可見部分神經(jīng)元細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、邊集,線粒體內(nèi)器官溶解,出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體。 3、免疫熒光可觀察到假手術(shù)組9個時間點(diǎn)Beclin1少量陽性表達(dá),模型組Beclin1表達(dá)2h開始增加,各時間點(diǎn)陽性表達(dá)明顯比假手術(shù)組增加。雷帕霉素組陽性表達(dá)明顯增加,而3-甲基腺嘌呤組陽性表達(dá)明顯下降。Beclin1陽性表達(dá)分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中無表達(dá)。 4、Western blot結(jié)果可觀察到發(fā)現(xiàn)HIBD后2h Beclin1蛋白表達(dá)開始增加,24h達(dá)到高峰,持續(xù)到168h(744.48+61.812,P0.05)。在四組中,24h Beclin1陽性表達(dá)雷帕霉素組最高,模型組次之,假手術(shù)組較少,3-甲基腺嘌呤組最少。 5、免疫組化可觀察到Caspase-3日性細(xì)胞主要位于細(xì)胞質(zhì),呈棕黃色質(zhì)棕褐色,彌漫分布于海馬及皮層組織。模型組與假手術(shù)組相較,海馬組織與皮層組織Caspase-3陽性表達(dá)平均光密度值各時間點(diǎn)明顯增加；雷帕霉素組與模型組相較,Caspase-3陽性表達(dá)平均光密度值顯著下降；而3-甲基腺嘌呤組與模型組相較,Caspase-3陽性表達(dá)平均光密度值顯著增高。 結(jié)論： 1、新生大鼠HIBD模型能激活自噬發(fā)生,HIBD后24h達(dá)高峰,隨著疾病發(fā)展而降低。 2、自噬水平增高可抑制細(xì)胞凋亡,自噬水平降低可增加細(xì)胞凋亡。 3、自噬可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡機(jī)制保護(hù)缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)損傷。
【關(guān)鍵詞】：缺氧缺血性腦損傷 自噬 Beclin1 Caspase-3 雷帕霉素 3-甲基腺嘌呤
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-24
• 參考文獻(xiàn)21-24
• 第二章 建立新生大鼠HIBD動物模型,觀察自噬在HIBD中的水平動態(tài)變化24-46
• 引言24
• 1. 材料與方法24-32
• 2. 結(jié)果32-41
• 3. 討論41-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 第三章 觀察缺氧缺血性腦損傷自噬水平變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系46-72
• 引言46-47
• 1. 材料與方法47-54
• 2. 結(jié)果54-65
• 3. 討論65-68
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 第四章 全文總結(jié)72-73
• 中英文縮略詞對照表73-74
• 在讀期間論文發(fā)表情況74-75
• 致謝75-77

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本文編號：840922