本文關(guān)鍵詞：甲潑尼龍琥珀酸鈉對腎上腺素致大鼠神經(jīng)源性肺水腫肺組織中的AQP5表達(dá)的影響

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【摘要】：神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenic Pulmonary Edema, NPE）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。是指無原發(fā)性心、肺、腎等疾病,由中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾�。ㄈ顼B腦損傷等）引起的突發(fā)性的顱內(nèi)壓增高而導(dǎo)致的肺水腫,也稱中樞性肺水腫。近年來,常由發(fā)病率顯著升高的重癥手足口病(EV71感染)導(dǎo)致,使過多的液體蓄于肺間質(zhì)或肺泡內(nèi),形成間質(zhì)性或肺泡性肺水腫。重癥手足口病所致神經(jīng)源性肺水腫的臨床表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸窘迫、咳粉紅色泡沫痰、咯血、呼吸循環(huán)衰竭等急性癥狀,其發(fā)病急,病情較兇險,進(jìn)展迅猛,治療困難、死亡率高（90%）~[1]。在醫(yī)學(xué)界,對NPE發(fā)病機(jī)制的研究一直是比較活躍的一個領(lǐng)域,盡管有許多學(xué)者對此已經(jīng)做了大量的研究工作,但神經(jīng)源性肺水腫的確切機(jī)理至今仍不十分清楚。在其病理改變中，肺部通透性增加是一個特征性的表現(xiàn)。 AQP5廣泛分布于肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的腔頂面,還位于鼻咽和呼吸道黏膜下腺上皮細(xì)胞腔頂面及氣道上皮細(xì)胞腔膜面，AQP5在肺組織中表達(dá)最多。是肺組織水轉(zhuǎn)運功能中液體快速轉(zhuǎn)運的通道,對維持肺組織的正常生理功能、肺水轉(zhuǎn)運中起到不可低估的作用。甲潑尼龍琥珀酸鈉是人工合成的糖皮質(zhì)激素，在治療手足口病中，是一種常用的物，藥作用時間屬中效類，具有強(qiáng)大的抗炎作用,可以改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能,減輕炎癥和水腫[2]，減少兒茶酚胺的縮血管功能和血栓的形成~[3]，能降低毛細(xì)血管通透性，減輕肺水腫，同時有效防治腦水腫，阻斷肺水腫-腦水腫的惡性循環(huán)。本實驗通過觀察不同劑量的甲強(qiáng)龍（甲潑尼龍琥珀酸鈉）對腎上腺素誘導(dǎo)的神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達(dá)、病理形態(tài)學(xué)、濕干重比值等的影響，探討其對神經(jīng)源性肺水腫的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的： 觀察不同劑量的甲潑尼龍琥珀酸鈉對腎上腺素誘導(dǎo)的神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5的表達(dá)、病理形態(tài)學(xué)、濕干重比值等的影響，探討其對神經(jīng)源性肺水腫是否具有保護(hù)性作用差異。 方法： 1動物模型的制備 Wistar大鼠雌雄不拘，1月齡，體重100±8g,腹腔注射腎上腺素造模型，神經(jīng)源性肺水腫組大鼠按2.7mg／kg給予腹腔注射腎上腺素注射液（1mg:1ml），觀察20min左右，大多數(shù)大鼠腹腔注射后約5min左右出現(xiàn)呼吸頻率加快、弓背,15min可見呼吸困難，若存活時間大于20min者,則造模成功。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠臥位置于操作臺上，，去毛。取上腹正中切口，打開胸腔，結(jié)扎氣管，取出雙肺。 2動物分組 將Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組(n=10)、神經(jīng)源性肺水腫組(NPE組，n=10)、甲強(qiáng)龍治療組(n=30)，后又以不同劑量分為三個亞組，每個亞組10只大鼠。其中甲強(qiáng)龍治療組于造模后立即腹腔注射。 3肺形態(tài)觀察 麻醉大鼠后，迅速開胸，暴露氣管，用線扎住氣管下端把肺完整地取下,觀察肺的顏色和形態(tài)。 4肺濕干重比檢測 用吸水紙吸干大鼠右肺中葉表面水分和血液，電子天平稱濕重。將右肺中葉置于65℃烘箱內(nèi)72h至恒重，再稱干重，計算右肺中葉濕/干重比值(W/D)。 5病理形態(tài)學(xué)觀察 分別取左肺放入4%甲醛中固定，4℃存放至肺組織沉到瓶底，之后脫水、透明、包埋、石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。 6肺組織AQP5免疫組化染色 采用鏈霉素-親合素-生物素過氧化物酶法(SABC)。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后,用3%過氧化氫去除內(nèi)源性氧化酶,微波抗原修復(fù),余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性片作為陽性對照,以PBS代替一抗作為陰性對照。AQP5抗體稀釋濃度為1：400。光鏡下出現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著染者為陽性表達(dá)細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇10個視野(200×)測定其吸光度值(absorbance，A)，計算平均A值反映其表達(dá)強(qiáng)弱。 7實時定量PCR方法檢測AQP5mRNA表達(dá) 取右肺上葉組織，采用TRIzol試劑（購自invitrogen公司）參照說明書提取各組大鼠的肺細(xì)胞總RNA,再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以適量cDNA為模板。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于RealtimePCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件相同。AQP5引物(由invitrogen公司合成),引物序列：GAPDHβ-actin：上游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;下游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’;(244bp),AQP5上游引物5’-GTGACAGACAAGCCAATGGATAA-3’;下游引物5’-GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT-3’(287bp)。 8AQP5Western blot 取右肺下葉組織500mg加上1ml提取液用玻璃勻漿器勻漿后提取，4℃,12000r/min,離心5min,取上清液，然后加入等體積的2χSDS上樣緩沖液，在100℃水中煮沸5min。進(jìn)行凝膠電泳，每孔上樣等量的總蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉2h后，加入1:250的第一抗體過夜，再加入1:6500HRP標(biāo)記的第二抗體，室溫振搖2h, ECL顯色。使用Gel-pro凝膠分析軟件，測定其平均光密度值(OD值)，以光密度值代表AQP5蛋白的表達(dá)量。待測AQP5蛋白表達(dá)量與內(nèi)參照β-actin（GAPDH）表達(dá)量進(jìn)行對比，表示AQP5蛋白的相對表達(dá)水平。 結(jié)果： 1大鼠一般情況觀察 NPE組大鼠較對照組呼吸明顯加快、躁動，大鼠雙肺底可聞及濕羅音；各不同劑量甲強(qiáng)龍(Methylprednisolone MP)治療組大鼠呼吸無明顯加快、躁動，主要表現(xiàn)為活動減少，存活時間延長。 2肺組織形態(tài)學(xué)觀察 對照組的肺外觀呈白色,較實,沒有水腫。NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶,氣管內(nèi)可見泡沫樣液體。甲強(qiáng)龍各治療組較NPE組雙肺體積減小，水腫減輕,肺表面散在點狀或小片狀暗紅色出血灶�？梢婋S治療量增加，出血、水腫明顯減輕。 3肺W/D重比值 NPE組W/D(6.6080±0.4319)與對照組(4.0870±0.5279)相比，明顯升高（P0.05），各甲強(qiáng)龍治療組W/D比NPE組明顯降低（P0.05），三組相比(5.8279±0.8050)、(5.2430±0.3359)、(4.5900±0.5390)，MP30mg/kg治療組W/D最低（P0.05）。 4肺組織病理學(xué)改變 對照組肺泡腔無充血、出血,肺泡結(jié)構(gòu)清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結(jié)構(gòu)，肺泡壁增寬，肺泡過度擴(kuò)張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細(xì)胞。各MP治療組與NPE組相比，病理改變明顯減輕。 5肺組織AQP5免疫組化染色 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以IOD值表示AQP5蛋白表達(dá)的相對強(qiáng)度,正常對照組肺組織中AQP5在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的腔頂面有廣泛而強(qiáng)烈的表達(dá)。NPE組（0.0784±0.0095）與對照組（0.5572±0.0834）相比，AQP5蛋白表達(dá)較對照組減少,染色變淺，AQP5表達(dá)明顯減弱（P0.05）；甲強(qiáng)龍各治療組A組、B組、C組(0.2385±0.0676)(0.3441±0.0673)(0.4432±0.0653)較NPE組（0.0784±0.0095）AQP5表達(dá)顯著加強(qiáng)（P0.05）；A組、B組、C組(0.2385±0.0676)、(0.3441±0.0673)、(0.4432±0.0653)三組相比，C組(0.4432±0.0653)AQP5密度最高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 6AQP5mRNA表達(dá)水平 在287bp處可見AQP5mRNA表達(dá), NPE組與對照組相比，AQP5表達(dá)明顯減弱（P0.05）；甲強(qiáng)龍各治療組較NPE組AQP5表達(dá)顯著加強(qiáng)（P0.05）；A組、B組、C組三組相比，C組AQP5mRNA表達(dá)水平最高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 7AQP5蛋白表達(dá)水平 NPE組（0.2165±0.0202）肺組織AQP5表達(dá)與對照組（0.6470±0.1518）相比，AQP5表達(dá)明顯減少（P0.05）；甲強(qiáng)龍各治療組A組、B組、C組（0.3641±0.0202）（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）肺組織AQP5表達(dá)較NPE組（0.2165±0.0202）AQP5表達(dá)明顯增強(qiáng)（P0.05）；A組、B組、C組（0.3641±0.0202））（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）三組相比，C組（0.5243±0.0937）表達(dá)明顯增強(qiáng)，有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： 1給予腹腔注射腎上腺素注射液（1mg:1ml），肉眼可見NPE組雙肺體積明顯增大、水腫、淤血、表面分布大片狀暗紅色出血灶,氣管內(nèi)可見泡沫樣液體。HE染色發(fā)現(xiàn)對照組肺泡腔無充血、出血,肺泡結(jié)構(gòu)清晰。NPE組在光鏡下肺泡失去正常的結(jié)構(gòu)，肺泡壁增寬，肺泡過度擴(kuò)張，肺泡腔充滿大量出血及炎性細(xì)胞。且肺濕/干重比明顯增加，綜上說明大鼠NPE模型制備成功。 2腎上腺素誘導(dǎo)的神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺組織AQP5表達(dá)較正常對照組顯著降低，提示AQP5在肺臟的水液平衡中起作用，在神經(jīng)源性肺水腫時是一種保護(hù)蛋白。因而我們推測AQP5的表達(dá)減少導(dǎo)致肺泡水清除率能力下降，推測可能導(dǎo)致神經(jīng)源性肺水腫的形成。 3在應(yīng)用甲潑尼龍琥珀酸鈉治療后可使神經(jīng)源性肺水腫大鼠肺濕/干比值（W/D）降低，AQP5表達(dá)上升，肺水腫減輕，說明甲潑尼龍琥珀酸鈉對AQP5的表達(dá)有上調(diào)作用。推測可能通過上調(diào)AQP5的含量或者活性,增強(qiáng)肺水腫肺泡水清除率，從而治療神經(jīng)源性肺水腫，隨著甲潑尼龍琥珀酸鈉劑量的增加，AQP5表達(dá)增加，肺泡水清除率能力增加，從而肺水腫程度減輕�？赡苁侵委煼嗡[的有效途徑。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)源性肺水腫 腎上腺素 水通道蛋白-5 甲潑尼龍琥珀酸鈉 大鼠
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R725.6
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-17
• 材料與方法17-27
• 結(jié)果27-29
• 附圖29-35
• 附表35-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 綜述 EV71 在手足口病中的研究進(jìn)展43-52
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 致謝52-53
• 個人簡歷53

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：820121