本文關(guān)鍵詞：引起手足口病的柯薩奇病毒A組10型在中國的流行及基因特征

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【摘要】：研究背景：手足口病(Hand, foot, and mouth disease, HFMD)是一種兒童常見的傳染病,其致病原可以有由多種人腸道病毒引起,以5歲以下的嬰幼兒為主。近年來,HFMD發(fā)病率顯著升高,并呈現(xiàn)出季節(jié)性流行和全年散發(fā)的趨勢。多種腸道病毒均可引起HFMD,其中以EV-A71及CV-A16型最為常見。除此之外,柯薩奇病毒A10型(Coxsackievirus A10, CV-A10)等其他柯薩奇A組病毒在手足口病病原譜中也逐漸呈上升趨勢。目前的研究表明CV-A10�？蓪�(dǎo)致一些輕癥的疾病,如手足口病、皰疹性咽峽炎等,但是國內(nèi)外也有病毒性腦膜炎、死亡等重癥病例的報道。盡管目前CV-A10在手足口病病原譜中占一定的比例,但目前對其在HFMD中的病原構(gòu)成、我國地域的分布和基因變異變遷規(guī)律的研究報道較少。本研究針對我國2004-2012年從HFMD分離到的CV-A10的VP1基因變異變遷進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和研究,并對我國本土流行基因型的3D區(qū)的基因特征進(jìn)行了重組分析。研究目的：本研究通過對國內(nèi)2009-2012年9省市57份導(dǎo)致手足口病的CV-A10的VP1區(qū)基因變異變遷規(guī)律及3D區(qū)的基因重組的分析,獲得國內(nèi)CV-A10的分子流行病學(xué)特征,為手足口病的病原學(xué)診斷、CV-A10相關(guān)的HDMD的防控工作提供了重要的病毒學(xué)基礎(chǔ)資料。研究方法：參照腸道病毒病毒分離鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法,對HFMD臨床標(biāo)本中實(shí)時定量熒光RT-PCR (rRT-PCR)檢測結(jié)果為非EV71和非CA16的其他腸道病毒進(jìn)行病毒分離,提取陽性分離株的RNA,進(jìn)行VP1編碼區(qū)5’端或3’端的的RT-PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的核苷酸序列測定,獲得序列經(jīng)sequencher 5.0和BLAST分析,鑒定腸道病毒血清型別。篩選鑒定為CV-A10的毒株,用自行設(shè)計的VP1區(qū)、3D區(qū)特異性引物擴(kuò)增VP1編碼區(qū)和3D區(qū),PCR產(chǎn)物經(jīng)基因序列測定。VP1區(qū)序列與Genebank中檢索到的其他的CV-A10的毒株的VP1區(qū)進(jìn)行核苷酸同源性分析。挑選基因型B和基因型D各1株代表株,將其3D區(qū)基因序列與所有A組原型株序列及Blast后親緣關(guān)系最近的序列的3D區(qū)比較。研究結(jié)果：本研究從2009-2012年HFMD病例中共分離CV-A10病毒57株,并獲得的57條VP1全長基因序列。從GenBank下載1950-2012所有VP1序列175條,依據(jù)VPl全長構(gòu)建親緣性進(jìn)化樹。依據(jù)VP1基因國際上現(xiàn)將CV-A10劃分為A、B、C和D四個基因型,本研究的57株中的56株CV-A10與國內(nèi)大部分CV-A10均屬于基因型C,只有1株屬于基因型B。1.C基因型的中國CV-A10來源于2008-2012年分離株,其核苷酸同源性為93.93%-100%,氨基酸同源性為96.84%-100%；這5年病毒株存在明顯年代與基因變異變遷的進(jìn)化關(guān)系,2011-2012毒株組成cluster 1,多聚集于tree的頂端；而2008-2010(cluster 2)多位于樹的末端,兩者核苷酸差異為3.6%～6.2%；2. B基因型的中國CA10來源于2004-2009年分離株,包括2009年湖南的1株、2004-2008年山東的5株和2009年深圳2株,其核苷酸同源性為90.6～97.5%,氨基酸同源性為97.8%-100%；其與其他基因型的核苷酸差異為15.48%-21.9%,氨基酸差異為4.7%-9.3%；3.依據(jù)3D區(qū)序列,提示CV-A10已發(fā)生明顯重組,且不同的基因型存在兩個不同的重組方式。本研究C基因型代表株CQ12-6與CV-A5原型株親緣關(guān)系最近,核苷酸同源性為81.7%；本研究中國2009年分離的B基因型代表株HUN09-22與2009年分離于臺灣的CV-A6 (GenBank號為JQ946050)親緣關(guān)系最近,其核苷酸同源性為94.3%,同時與CV-A4、CV-A14及CV-A16原型株位于同一個進(jìn)化分枝上,其核苷酸同源性分別為83.6%、83.0%和84.1%；4.通過對中國疾病預(yù)防信息系統(tǒng)HFMD病原構(gòu)成分析,提示四川省2011-2013年非EV-A71非CV-A16其他腸道病毒在實(shí)驗(yàn)室檢測病例所占比例逐漸上升,分別為15%、33%、48%。本研究證實(shí)在2013年其他腸道病毒的病原構(gòu)成中CV-A6占51%,CV-A10占10%。結(jié)論：1.我國CV-A10本土流行株有兩個基因型C和B,這2個基因型在3D區(qū)存在不同的重組進(jìn)化方式。C基因型VP1區(qū)存在明顯年代與基因變異變遷的動態(tài)進(jìn)化關(guān)系；2.最近三年CV-A6、CV-A10等導(dǎo)致HFMD的其他腸道病毒有增多趨勢。3.本研結(jié)果為CV-A10相關(guān)的HFMD的診斷、防控工作提供了重要的病毒學(xué)基礎(chǔ)資料。
【關(guān)鍵詞】：手足口病 CV-A10 流行 基因特征
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 縮略語12-14
• 1. 引言14-22
• 1.1. 手足口病14-17
• 1.1.1. 病原學(xué)14-15
• 1.1.2. 流行病學(xué)15
• 1.1.3. 臨床表現(xiàn)15
• 1.1.4. 流行概況15-16
• 1.1.5. 治療與預(yù)防16-17
• 1.2. 腸道病毒17-20
• 1.2.1. 腸道病毒發(fā)現(xiàn)歷史17-18
• 1.2.2. 腸道病毒分子結(jié)構(gòu)18-19
• 1.2.3. 腸道病毒的分型19-20
• 1.2.4. 腸道病毒與疾病20
• 1.3. 柯薩奇A組10型20-22
• 1.3.1. CV-A10的流行歷史20-21
• 1.3.2. CV-A10與疾病21
• 1.3.3. CV-A10分子特征研究概述21
• 1.3.4. 手足口病病原譜構(gòu)成變化21-22
• 2. 材料和方法22-40
• 2.1. 材料22-26
• 2.1.1. 毒株來源22
• 2.1.2. 毒株篩選22
• 2.1.3. 主要試劑22-25
• 2.1.4. 主要耗材25
• 2.1.5. 主要儀器25-26
• 2.2. 采集標(biāo)本的種類、保存和運(yùn)輸26-27
• 2.2.1. 糞便標(biāo)本26-27
• 2.2.2. 咽拭子標(biāo)本27
• 2.2.3. 肛拭子標(biāo)本27
• 2.2.4. 注意事項(xiàng)27
• 2.3. 標(biāo)本的處理27-28
• 2.3.1. 糞便標(biāo)本和肛拭子的處理27-28
• 2.3.2. 咽拭子標(biāo)本的處理28
• 2.4. 病毒分離28-32
• 2.4.1. 細(xì)胞培養(yǎng)28-30
• 2.4.2. 接種和觀察(病毒分離)30-32
• 2.5. 腸道病毒分型鑒定32-36
• 2.5.1. 臨床標(biāo)本病毒RNA提取32
• 2.5.2. 病毒培養(yǎng)物RNA提取32
• 2.5.3. 引物來源32-33
• 2.5.4. PCR擴(kuò)增33-34
• 2.5.5. PCR產(chǎn)物的鑒定34
• 2.5.6. PCR產(chǎn)物純化回收34-35
• 2.5.7. 標(biāo)記反應(yīng)35
• 2.5.8. 記反應(yīng)產(chǎn)物純化35-36
• 2.5.9. 序列測定36
• 2.6. 序列整理和其他相關(guān)分析軟件36
• 2.7. CV-A10 VP1區(qū)、3D特異性擴(kuò)增引物36-37
• 2.8. CV-A10 VP1區(qū)全長、3D區(qū)序列獲得37-38
• 2.8.1. RT-PCR擴(kuò)增CV-A10 VP1區(qū)全長及3D區(qū)37-38
• 2.8.2. CV-A10PCR產(chǎn)物的鑒定38
• 2.8.3. 產(chǎn)物純化回收38
• 2.8.4. 標(biāo)記反應(yīng)38
• 2.8.5. 標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物純化38
• 2.8.6. 序列測定38
• 2.8.7. 序列整理38
• 2.9. 序列比對及同源性分析38-39
• 2.10. 中國CV-A10毒株3D區(qū)重組分析39
• 2.11. CV-A10在手足口病病原譜中的構(gòu)成39-40
• 3. 結(jié)果40-53
• 3.1. 毒株信息40
• 3.2. CV-A10的VP1區(qū)特異性引物擴(kuò)增結(jié)果40-41
• 3.3. 測序結(jié)果41-42
• 3.4. 同源性分析42-45
• 3.5. 國內(nèi)CV-A10同源性分析45-49
• 3.6. 中國CV-A10毒株3D區(qū)重組分析49-52
• 3.7. CV-A10在手足口病病原譜中的構(gòu)成52-53
• 4. 討論53-58
• 4.1. CV-A10流行現(xiàn)狀53-54
• 4.2. CV-A10流行病學(xué)特征54
• 4.3. CV-A10遺傳進(jìn)化關(guān)系54-55
• 4.4. CV-A10基因分型55-56
• 4.5. CV-A10基于3D區(qū)的基因重組分析56
• 4.6. CV-A10在手足口病病原譜中的構(gòu)成56-57
• 4.7. 手足口病診斷和防控工作挑戰(zhàn)57-58
• 5. 小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述 手足口病的流行病學(xué)恃征與研究進(jìn)展62-72
• 參考文獻(xiàn)69-72
• 致謝72-74
• 碩士期間發(fā)表文章74

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本文編號：807497