本文關(guān)鍵詞：microRNA-709負性調(diào)控線粒體功能參與腎小管上皮細胞損傷及其機制研究

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【摘要】：急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是臨床常見的危重癥,是各種原因引起的急性腎臟功能下降、伴或不伴有少尿或無尿的一種臨床綜合征,病死率較高,AKI也是引起慢性腎功能不全(ESRD)的重要原因,對患者的生命安全造成嚴重威脅。因此,研究AKI腎臟損傷相關(guān)機制,對早期防治AKI及ESRD具有重要意義。在AKI過程中,腎小管上皮細胞是主要受損細胞,主要表現(xiàn)為小管細胞去分化,上皮細胞標志消失,細胞極性消失,細胞凋亡甚至壞死。micro RNA是一類廣泛存在于真核生物中長2l~25堿基的非編碼微小RNA,通過與靶基因3’UTR結(jié)合從而抑制其轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達,涉及包括發(fā)育、細胞增殖和分化以及凋亡等廣泛的生物學(xué)過程。多項研究證實micro RNA與急慢性腎損傷的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本課題組前期在醛固酮灌注小鼠模型的腎皮質(zhì)組織中發(fā)現(xiàn)mi R-709較正常對照組明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn),肝臟中mi R-709隨年齡的增長其表達逐漸增加。mi R-709在急性腎損傷中的作用還未見報道。線粒體是合成ATP、電子傳遞和氧化磷酸化的主要場所。線粒體功能障礙在腎損傷中的作用已得到廣泛關(guān)注。業(yè)已證明,在缺血再灌注及腎毒性藥物所致的急性腎損傷模型中,均存在線粒體形態(tài)異常、線粒體DNA突變、線粒體DNA拷貝數(shù)下降以及細胞凋亡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙是醛固酮小鼠腎損傷模型、順鉑(cisplatin)急性腎損傷模型的早期事件。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,通過順鉑誘導(dǎo)急性腎小管上皮細胞損傷,觀察mi R-709表達變化;調(diào)控mi R-709的表達水平,觀察其在腎小管上皮細胞損傷中的作用及其分子機制。研究共分為三部分:mi R-709在順鉑誘導(dǎo)急性腎小管上皮細胞損傷中的表達變化及mi R-709過表達、抑制對腎小管上皮細胞凋亡、上皮細胞標志蛋白、急性腎損傷標志物表達及線粒體功能的影響;腎小管上皮細胞中mi R-709靶基因的篩選與鑒定。研究mi R-709在順鉑誘導(dǎo)急性腎小管上皮細胞損傷中的作用并探討其可能機制,從而為急性腎損傷的發(fā)病機制、治療靶點提供新的思路。第一部分micro RNA-709在順鉑誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷中的表達及作用目的:觀察mi R-709在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷中的表達及作用。方法:體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,應(yīng)用不同劑量的順鉑(0、1、5、10、20μmol/L)刺激24h或10μmol/L劑量的順鉑刺激不同時間(0、2、6、12、24h)。采用實時熒光定量PCR檢測腎小管上皮細胞內(nèi)mi R-709的表達變化。應(yīng)用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染mi R-709 mimic或mi R-709 inhibitor。mi R-709過表達實驗分組為:NC(negative control)過表達對照組、mi R-709 mimic(過表達mi R-709)組;mi R-709表達抑制實驗分組為:INNC(inhibitor negative control)下調(diào)對照組,mi R-709 inhibitor(下調(diào)mi R-709)組,INNC+cisplatin,mi R-709inhibitor+cisplatin。流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)目;分光光度法檢測凋亡相關(guān)分子caspase-3的底物活性;應(yīng)用實時熒光定量PCR和western blot法分別檢測腎小管上皮細胞連接蛋白E-cadherin、急性腎損傷標志物腎損傷分子(KIM-1)和中性粒細胞明膠酶運載蛋白(NGAL)m RNA和蛋白表達。結(jié)果:(1)順鉑可呈劑量及時間依賴性誘導(dǎo)腎小管上皮細胞mi R-709的表達。與對照組相比,5μmol/L順鉑刺激腎小管上皮細胞24h后,mi R-709表達開始升高(升高2.15倍),10、20μmol/L順鉑刺激24h mi R-709分別升高5.35倍、5.7倍,均P0.05;腎小管上皮細胞經(jīng)10μmol/L順鉑刺激12h后mi R-709升高1.63倍,24h升高達高峰(升高5.3倍);(2)過表達mi R-709腎小管上皮細胞凋亡及caspase-3活化顯著增加(分別增加0.54倍、0.31倍,均P0.05),E-cadherin表達減少(減少59.3%),急性腎損傷標志物KIM-1、NGAL表達增加(分別增加0.4倍、0.62倍,均P0.05);(3)下調(diào)mi R-709可減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡、caspase-3活化、E-cadherin表達下降及KIM-1和NGAL表達增加。結(jié)論:順鉑呈劑量及時間依賴性地誘導(dǎo)腎小管上皮細胞中mi R-709的表達;過表達mi R-709可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷,下調(diào)mi R-709對順鉑誘導(dǎo)的急性腎小管上皮細胞損傷具有保護作用。第二部分micro RNA-709對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙的影響目的:明確miR-709對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙的影響。方法:體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,應(yīng)用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染mi R-709mimic或mi R-709 inhibitor。mi R-709過表達實驗分組為:NC(negative control)過表達對照組、mi R-709 mimic(過表達mi R-709)組;mi R-709表達抑制實驗分組為:INNC(inhibitor negative control)下調(diào)對照組,mi R-709 inhibitor(下調(diào)mi R-709)組,INNC+cisplatin,mi R-709 inhibitor+cisplatin。應(yīng)用JC-1染色流式細胞儀結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位;流式細胞儀檢測線粒體超氧化物(mitochondrial superoxide,mito SOX)生成;定量PCR檢測線粒體基因(mt DNA)拷貝數(shù);分光光度法檢測線粒體途徑凋亡相關(guān)分子caspase-9的底物活性。結(jié)果:(1)過表達mi R-709后腎小管上皮細胞線粒體膜電位和mt DNA拷貝數(shù)下降(分別下降34.2%、41.8%,均P0.05),ROS生成及caspase-9活性增加(分別增加0.31倍、0.33倍,均P0.05);(2)下調(diào)mi R-709可減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙,包括減輕線粒體膜電位和mt DNA拷貝數(shù)下降、抑制ROS的生成及caspase-9的活化。結(jié)論:過表達mi R-709可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞線粒體功能障礙,下調(diào)mi R-709對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體障礙有保護作用。第三部分腎小管上皮細胞中micro RNA-709靶基因的篩選與鑒定目的:篩選并鑒定腎小管上皮細胞中mi R-709的靶基因,明確其介導(dǎo)腎小管上皮細胞損傷的分子機制。方法:體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,應(yīng)用不同劑量的順鉑(0、1、5、10、20μmol/L)刺激24h或10μmol/L劑量的順鉑刺激不同時間(0、2、6、12、24h)。實時熒光定量PCR和western blot檢測線粒體轉(zhuǎn)錄因子(mitochondrial transcription factor A,TFAM)表達變化。體外培養(yǎng)小鼠腎小管上皮細胞,應(yīng)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染pc DNA3.1-TFAM,過表達TFAM后再應(yīng)用cisplatin刺激。應(yīng)用RNA Hybrid軟件對TFAM的3′UTR與相應(yīng)的mi R-709互補結(jié)合位點的核苷酸序列的自由能進行分析。構(gòu)建TFAM熒光素酶報告基因,過表達mi R-709后檢測TFAM熒光素酶報告基因的活性。過表達mi R-709,應(yīng)用實時熒光定量PCR和western blot檢測腎小管上皮細胞TFAM m RNA及蛋白表達。進一步驗證TFAM在mi R-709介導(dǎo)腎小管上皮細胞線粒體功能障礙及腎小管上皮細胞損傷中的作用。TFAM過表達分組為:vehicle+NC組,vehicle+mi R-709mimic組,TFAM+NC組,TFAM+mi R-709 mimic組,應(yīng)用實時熒光定量PCR和western blot法驗證腎小管上皮細胞線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM的過表達;應(yīng)用實時熒光定量PCR和western blot檢測腎小管上皮細胞連接蛋白E-cadherin、急性腎損傷標志物腎損傷分子(KIM-1)和NGAL表達;Annexin V-PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡;分光光度法檢測凋亡相關(guān)分子caspase-3的底物活性;JC-1染色后流式細胞儀結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位;流式細胞儀檢測線粒體超氧化物生成;定量PCR檢測線粒體基因(mt DNA)拷貝數(shù);分光光度法檢測線粒體途徑凋亡相關(guān)分子caspase-9的底物活性。結(jié)果:(1)順鉑呈劑量及時間依賴性抑制腎小管上皮細胞TFAM表達。5μmol/L順鉑刺激腎小管上皮細胞24h后TFAM表達下降(下降34.2%),10、20μmol/L順鉑刺激后分別下降66.3%,67.9%,均P0.05;腎小管上皮細胞經(jīng)10μmol/L順鉑刺激12h后TFAM表達下降23.1%,24h后下降更顯著(下降52.3%)。(2)過表達TFAM可減輕順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞凋亡及線粒體功能障礙。TFAM過表達組順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡和caspase-3活化顯著降低,同時順鉑誘導(dǎo)的線粒體功能損傷指標包括線粒體膜電位和mt DNA拷貝數(shù)降低、ROS產(chǎn)生及線粒體途徑凋亡相關(guān)分子caspase-9活化均得到了抑制。(3)腎小管上皮細胞中mi R-709靶基因TFAM的鑒定:RNA Hybrid軟件在線分析TFAM的3′UTR與mi R-709互補結(jié)合位點的核苷酸序列的最小自由能是-27.1kcal/mol,低于隨機平均自由能閾值;熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)過表達mi R-709可以降低pmir GLO-TFAM 3′UTR-WT的熒光素酶活性,其活性下降了32.5%,而pmir GLO-TFAM 3′UTR-MUT與mi R-709 mimic共同轉(zhuǎn)染小管上皮細胞其熒光素酶活性沒有明顯變化;過表達mi R-709后,TFAM的m RNA和蛋白水平均明顯下降(分別下降68.1%,40%,均P0.05)。(4)TFAM過表達可阻斷mi R-709介導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙和腎小管上皮細胞損傷。結(jié)論:mi R-709通過靶向調(diào)控TFAM的表達負性調(diào)控線粒體功能參與腎小管上皮細胞損傷。
【關(guān)鍵詞】：miR-709 mimic miR-709 inhibitor 急性腎小管上皮細胞損傷 順鉑 mi R-709 mimic mi R-709 inhibitor 線粒體功能障礙 順鉑 mi R-709 TFAM 線粒體功能障礙 腎小管上皮細胞損傷
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R726.9
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-14
• 前言14-18
• 第一部分 microRNA-709在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞損傷中的表達及作用18-37
• 材料與方法18-28
• 結(jié)果28-33
• 討論33-37
• 第二部分 microRNA-709對順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體功能障礙的影響37-47
• 材料與方法37-41
• 結(jié)果41-44
• 討論44-47
• 第三部分 腎小管上皮細胞中microRNA-709靶基因的篩選與鑒定47-62
• 材料與方法47-51
• 結(jié)果51-59
• 討論59-62
• 全文小結(jié)62-63
• 參考文獻63-72
• 英文縮略詞72-73
• 綜述73-85
• 參考文獻80-85
• 附錄85-86
• 致謝86-87

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