本文關鍵詞：協(xié)同信號分子B7-H3對肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠腦損傷的影響

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【摘要】：實驗目的： 細菌性腦膜炎是兒童時期較嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，近年來，盡管給予有效的抗生素治療，但是細菌性腦膜炎仍有較高的死亡率和致殘率，因此進一步研究細菌性腦膜炎的免疫病理機制，尋找新的免疫干預手段意義重大。細菌性腦膜炎導致血腦屏障破壞和腦組織損傷，而腦組織損傷的嚴重程度決定了細菌性腦膜炎患者的預后。有諸多研究已證實在細菌性腦膜炎時腦內神經(jīng)元會發(fā)生壞死、凋亡等改變。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）和S100b已經(jīng)被證實是腦損傷的特異性標志物，誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）能夠生物合成(nitric oxide,NO)，它已經(jīng)被證實在細菌性腦膜炎引起的神經(jīng)細胞凋亡中扮演者重要角色。協(xié)同信號分子是介導抗感染免疫應答過程的重要成分，B7同源性3（B7Homology3，B7-H3）是B7家族的新成員，它在抗感染免疫應答中發(fā)揮著重要的免疫調控作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)細菌性腦膜炎患兒體內可溶性B7-H3分子異常高表達，此外還發(fā)現(xiàn)在小鼠肺炎鏈球菌（S. Pneumoniae，SP）腦膜炎模型中B7-H3加劇了SP腦膜炎的病理損傷（血腦屏障的破壞），增強了炎癥趨化作用。本研究是在以上前期工作的基礎上進一步觀察分析B7-H3對細菌性腦膜炎動物模型腦組織中神經(jīng)元壞死、腦細胞凋亡的影響，以及對腦損傷標志物NSE、S100b、iNOS表達的影響，探討B(tài)7-H3對細菌性腦膜炎小鼠腦損傷的影響，了解其在細菌性腦膜炎病情進展中的作用，以期為細菌性腦膜炎的免疫干預提供新的思路和實驗依據(jù)。 實驗方法： 1、研究B7-H3對SP腦膜炎小鼠神經(jīng)行為學改變、體質量的變化的影響，取月齡為1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，隨機分為4組：生理鹽水對照組（CON組）、B7-H3組（B7-H3組）、肺炎鏈球菌組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）；每組12只小鼠。腹腔注射誘導麻醉后，通過側腦室定位注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液來建立小鼠細菌性腦膜炎模型；CON組注射15ul無菌生理鹽水，B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul無菌生理鹽水，SP組注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液，SP+B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul肺炎鏈球菌混懸液。 2、分別于側腦室注射后18h、48h、72h對各組小鼠進行：1）神經(jīng)行為學評分、2）記錄體質量的變化（分別記錄注射前后在不同時間點小鼠的體重，分析前后體重差值的變化）。研究B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織中神經(jīng)細胞丟失（Nissl染色）和腦組織細胞凋亡（Tunel染色）的影響，評價腦損傷情況。關于動物模型及分組同實驗方法1.分別于側腦室注射后18h、48h、72h檢測小鼠腦組織中神經(jīng)細胞的丟失和凋亡。(通過顯微鏡觀察不同時間點小鼠腦組織中尼氏染色陽性細胞及凋亡陽性細胞數(shù)量的改變）。 3、分析B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織勻漿中腦損傷標志物NSE，S100b mRNA相對表達量及NSE,S100b,iNOS蛋白表達的影響，關于動物模型及分組同實驗方法1。分別于側腦室注射后18h、48h、72h對小鼠進行1）Real-time PCR方法檢測腦組織勻漿中腦損傷標志物NSE,S100b mRNA的相對表達量、2）免疫組織化學方法檢測腦組織中NSE,S100b,iNOS蛋白的表達。 實驗結果： 一、B7-H3對SP腦膜炎小鼠臨床癥狀的影響 1、神經(jīng)行為學評分：分別記錄各組小鼠側腦室注射后18h、48h、72h時的臨床評分。B7-H3組與CON組小鼠臨床評分：18h（5.0±0）vs（5.0±0）、48h（5.0±0）vs（5.0±0）、72h（5.0±0）vs（5.0±0），差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP組在18h、48h、72h臨床評分較CON組均明顯降低：18h（4.5±0.57）vs（5.0±0）、48h（3.5±0.57）vs（5.0±0）、72h（2.75±0.5）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP+B7-H3組在18h、48h、72h臨床評分均明顯低于CON組：18h（4.0±0）vs（5.0±0）、48h（3.0±0）vs（5.0±0）、72h（1.75±0.5）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01），且SP+B7-H3組與SP組相比進一步降低：18h（4.0±0）vs（4.5±0.57）、48h（3.0±0）vs（3.5±0.57）、72h（1.75±0.5）vs（2.75±0.5），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2、體質量變化：分別記錄各組小鼠側腦室注射前和注射后18h、48h、72h體質量的變化。B7-H3組與CON組小鼠在18h、48h、72h體質量變化：18h（-0.01±0.24）vs（-0.05±0.42）、48h（-0.02±0.12）vs（-0.28±0.34）、72h（-0.02±0.13）vs（-0.07±0.4），兩組間體質量變化無顯著差異（P0.05）；SP組接種細菌后18h、48h、72h時體重相對于CON組均降低：18h（0.8±0）vs（-0.05±0.42）、48h（1.48±0.05）vs（-0.28±0.34）、72h（2.53±0.07）vs（-0.07±0.4），差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP+B7-H3組小鼠在接種細菌和蛋白混懸液后體重明顯低于CON組：18h（1.5±0.17）vs（-0.05±0.42）、48h（2.0±0.02）vs（-0.28±0.34）、72h（3.23±0.12）vs（-0.07±0.4）（P0.05），SP+B7-H3組與SP組相比亦明顯降低：18h（1.5±0.17）vs（0.8±0）、48h（2.0±0.02）vs（1.48±0.05）、72h（3.23±0.12）vs（2.53±0.07），差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 二、B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織中神經(jīng)細胞的壞死和凋亡的影響。 1、Nissl染色四組小鼠腦組織中均有染色陽性的細胞,在腦組織中，B7-H3組尼氏染色陽性的神經(jīng)元細胞與CON組比較無明顯差異18h（113.33±5.77）vs（115.0±5.0）、48h（113.0±1.0）vs（113.0±2.65）、72h（108.67±3.21）vs（107.67±3.21），差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP組與CON組比較陽性細胞數(shù)量減少18h（105.0±5.0）vs（115.0±5.0）、48h（94.33±4.04）vs（113.0±2.65）、72h（89.33±0.58）vs（107.67±3.21），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP+B7-H3組18h、48h、72h與CON組比較明顯降低18h（90.0±1.0）vs（115.0±5.0），48h（82.0±2.65）vs（113.0±2.65）、72h（81.33±2.31）vs（107.67±3.21），差異具有顯著性（P0.01）；同時還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組陽性細胞數(shù)目均低于SP組（90.0±1.0）vs（105.0±5.0）、（82.0±2.65）vs（94.33±4.04）、72h（81.33±2.31）vs（89.33±0.58），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2、Tunel染色在腦組織中，B7-H3組Tunel染色陽性的凋亡細胞與CON組比較無明顯差異18h（0.67±0.57）vs（1.33±0.57）、48h（0.68±0.57）vs（0.67±0.58）、72h（1.0±1.0）vs（0.33±0.58），差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP組與CON組比較凋亡細胞增多18h（11.33±1.53）vs（1.33±0.57）、48h（19.0±1.0）vs（0.67±0.58）、72h（26.32±1.54）vs（0.33±0.58），差異具有顯著性（P0.01）；SP+B7-H3組18h、48h、72h與CON組比較凋亡細胞增多更明顯18h（17.67±2.08）vs（1.33±0.57），48h（26.33±1.53）vs（0.67±0.58）、72h（38.0±2.65）vs（0.33±0.58），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.01）；同時發(fā)現(xiàn)在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3與SP組比較凋亡細胞亦增多18h（17.67±2.08）vs（11.33±1.53），48h（26.33±1.53）vs（19.0±1.0）、72h（38.00±2.65）vs（26.32±1.54）（P0.05）。 三、B7-H3對SP腦膜炎小鼠腦組織中腦損傷標志物及iNOS的影響 1、Real-time PCR檢測腦組織勻漿中NSE，S100b mRNA的相對表達量：我們發(fā)現(xiàn)在細菌注射18h、48h、72h后，B7-H3組和CON組的NSE mRNA表達，18h（0.052±0.034）vs（0.028±0.01）、48h（0.02±0.001）vs（0.028±0.003）、72h（0.036±0.002）vs（0.028±0.001），差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）；細菌注射后18h時NSEmRNA相對表達量，SP組較CON組明顯升高（0.095±0.03）vs（0.028±0.01），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）； SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.124±0.049）vs（0.095±0.03），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。細菌注射后48h時NSE mRNA相對表達量，SP組較CON組明顯升高（0.177±0.021）vs（0.028±0.003），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.33±0.088）v（s0.177±0.021），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；細菌注射后72h時NSE mRNA相對表達量，SP組較CON組明顯升高（0.369±0.035）v（s0.028±0.001），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.529±0.02）vs（0.369±0.035），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 在細菌注射后B7-H3組和CON組的S100bmRNA表達，18h（0.04±0.018）vs（0.03±0.006）、48h（0.029±0.003）vs（0.029±0.002）、72h（0.048±0.001）vs（0.046±0.002），差別無統(tǒng)計學意義（P0.05）；細菌注射后18h時S100b mRNA相對表達量，SP組較CON組升高（0.061±.006）vs（0.03±0.006），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組升高（0.148±0.052）vs（0.061±.006），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；細菌注射后48h時S100b mRNA的相對表達量，SP組較CON組升高（0.185±0.012）vs（0.029±0.002），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組升高（0.194±0.018）vs（0.185±0.012），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；細菌注射后72h時S100b mRNA的相對表達量，SP組較CON組明顯升高（0.284±0.008）vs（0.046±0.002），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（1.62±0.118）vs（0.284±0.008），差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 2、腦組織免疫組織化學結果分析： 2.1腦組織中NSE蛋白的表達：在腦組織中，各組小鼠均有NSE陽性細胞表達，光鏡下為胞內基質有棕褐色顆粒沉積。我們發(fā)現(xiàn)在細菌注射后18h、48h、72h，B7-H3組與CON組比較NSE陽性細胞數(shù)目無明顯差異：18h（100.0±4.58）vs（99.67±0.58）、48h（100.33±0.58）vs（99.66±2.08）、72h（99.67±2.31）vs（100.0±2.0），差異無統(tǒng)計學意義，（P0.05）；SP組NSE陽性細胞數(shù)與CON組比較明顯減少18h（96.67±1.53）vs（99.67±0.58）、48h（82.0±2.65）vs（99.66±2.08）、72h（75.33±0.58）vs（100.0±2.0），差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。SP+B7-H3組NSE陽性細胞數(shù)與CON組比較在18h、48h、72h三個時間點均明顯減少（86.67±2.89）vs（99.67±0.58）、（66.0±5.29）vs（99.66±2.08）、（55.0±5.0）vs（100.0±2.0），差異具有顯著性（P0.01）。同時我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組NSE陽性細胞數(shù)目均少于SP組（86.67±2.89）vs（96.67±1.53）、（66.0±5.29）vs（82.0±2.65）、（55.0±5.0）vs（75.33±0.58），差異具有顯著性（P0.05）。 2.2腦組織中S100b蛋白的表達：在腦組織中，各組小鼠均有S100b陽性細胞表達。在B7-H3組、CON組18h、48h、72h均出現(xiàn)S100b免疫組化反應陽性，但陽性細胞數(shù)無明顯差異18h（23.45±1.98）vs（23.54±2.3）、48h（23.67±2.32）vs（23.53±2.12）、72h（23.78±2.34）vs（23.76±1.32）（P0.05），差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP組S100b表達較CON組明顯升高，18h（30.1±3.21）vs（23.54±2.3）、48h（38.23±3.23）vs（23.53±2.12）、72h（43.12±1.33）vs（23.76±1.32），差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP+B7-H3組S100b表達與CON組比較升高更明顯18h（40.6±1.45）vs（23.54±2.3）、48h（55.34±1.53）vs（23.53±2.12）、72h（68.12±2.89）vs（23.76±1.32），差異具有顯著性（P0.01）；同時我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點，SP+B7-H3組S100b表達均高于SP組，18h（40.6±1.45）vs（30.1±3.21）、48h（55.34±1.53）vs（38.23±3.23）、72h（68.12±2.89）vs（43.12±1.33），（P0.05）。 2.3腦組織中iNOS蛋白的表達：在腦組織中，用PBS替代一抗作為陰性對照，陰性對照未見免疫組化iNOS陽性染色顆粒；B7-H3組與CON組幾乎都無iNOS的表達。SP組iNOS表達與CON組比較明顯升高，18h（29.33±1.15）vs（0.0±0.0）、48h（45.0±5.0）v（s1.0±0.0）、72h（71.67±2.89）v（s0.0±0.0），差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.05）；SP+B7-H3組iNOS表達較CON組升高更明顯，18h（35.33±0.58）vs（0.0±0.0）、48h（56.33±1.53）vs（1.0±0.0）、72h（81.67±2.89）vs（0.0±0.0），差異均具有顯著性（P0.01）；同時我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個時間點SP+B7-H3組iNOS表達均高于SP組，18h（35.33±0.58）vs（29.33±1.15）、48h（56.33±1.53）vs（45.0±5.0）、72h（81.67±2.89）vs（71.67±2.89），差異均具有顯著性（P0.05）。 結論： 1、本實驗經(jīng)側腦室注射肺炎鏈球菌混懸液，成功建立了小鼠SP腦膜炎模型。 2、本實驗結果顯示：在SP腦膜炎模型中，小鼠臨床評分降低，體重減輕，腦組織中Nissl染色陽性的神經(jīng)元細胞減少，Tunel染色陽性凋亡細胞增多；腦損傷標志物分子NSE，S100b mRNA相對表達量及S100b，iNOS蛋白表達量升高，NSE蛋白陽性細胞在腦組織中減少，這些結果表明，SP腦膜炎小鼠模型發(fā)生了腦損傷。 3、協(xié)同信號分子B7-H3加劇了SP腦膜炎的臨床癥狀，促進了腦組織神經(jīng)細胞丟失、凋亡（Nissl染色陽性的神經(jīng)元細胞減少更明顯，，Tunel染色陽性凋亡細胞進一步增多）；并且使NSE、S100bmRNA的相對表達量和S100b、iNOS蛋白表達進一步升高，NSE蛋白陽性細胞進一步減少，表明B7-H3加劇了SP腦膜炎引起的腦損傷。
【關鍵詞】：B7-H3 SP腦膜炎 NSE S100b iNOS 腦損傷
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 中文摘要4-10
• Abstract10-18
• 引言18-23
• 參考文獻20-23
• 第一部分 B7-H3 對 SP 腦膜炎小鼠臨床癥狀（體質量變化、神經(jīng)行為學改變）的影響23-30
• 材料與方法23-27
• 實驗結果27-30
• 第二部分 B7-H3 對 SP 腦膜炎小鼠腦組織神經(jīng)細胞壞死（NISSL 染色）和凋亡（TUNEL 染色）的影響30-40
• 材料與方法30-35
• 實驗結果35-40
• 第三部分 B7-H3 對 SP 腦膜炎小鼠腦組織中腦損傷標志物 NSE、S100B 及 INOS 的影響40-55
• 材料與方法40-46
• 實驗結果46-55
• 討論55-62
• 參考文獻62-68
• 實驗結論68-69
• 綜述69-77
• 參考文獻74-77
• 中英文對照縮略詞表77-78
• 攻讀學位期間公開發(fā)表的論文78-79
• 本課題支助項目79-80
• 致謝80-81

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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本文編號：747510