本文關(guān)鍵詞：協(xié)同信號(hào)分子B7-H3對(duì)肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠腦損傷的影響

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?細(xì)菌性腦膜炎是兒童時(shí)期較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，近年來，盡管給予有效的抗生素治療，但是細(xì)菌性腦膜炎仍有較高的死亡率和致殘率，因此進(jìn)一步研究細(xì)菌性腦膜炎的免疫病理機(jī)制，尋找新的免疫干預(yù)手段意義重大。細(xì)菌性腦膜炎導(dǎo)致血腦屏障破壞和腦組織損傷，而腦組織損傷的嚴(yán)重程度決定了細(xì)菌性腦膜炎患者的預(yù)后。有諸多研究已證實(shí)在細(xì)菌性腦膜炎時(shí)腦內(nèi)神經(jīng)元會(huì)發(fā)生壞死、凋亡等改變。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）和S100b已經(jīng)被證實(shí)是腦損傷的特異性標(biāo)志物，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）能夠生物合成(nitric oxide,NO)，它已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)菌性腦膜炎引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中扮演者重要角色。協(xié)同信號(hào)分子是介導(dǎo)抗感染免疫應(yīng)答過程的重要成分，B7同源性3（B7Homology3，B7-H3）是B7家族的新成員，它在抗感染免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎患兒體內(nèi)可溶性B7-H3分子異常高表達(dá)，此外還發(fā)現(xiàn)在小鼠肺炎鏈球菌（S. Pneumoniae，SP）腦膜炎模型中B7-H3加劇了SP腦膜炎的病理損傷（血腦屏障的破壞），增強(qiáng)了炎癥趨化作用。本研究是在以上前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察分析B7-H3對(duì)細(xì)菌性腦膜炎動(dòng)物模型腦組織中神經(jīng)元壞死、腦細(xì)胞凋亡的影響，以及對(duì)腦損傷標(biāo)志物NSE、S100b、iNOS表達(dá)的影響，探討B(tài)7-H3對(duì)細(xì)菌性腦膜炎小鼠腦損傷的影響，了解其在細(xì)菌性腦膜炎病情進(jìn)展中的作用，以期為細(xì)菌性腦膜炎的免疫干預(yù)提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、研究B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠神經(jīng)行為學(xué)改變、體質(zhì)量的變化的影響，取月齡為1.5-2月的健康雄性BALB/C小鼠48只，隨機(jī)分為4組：生理鹽水對(duì)照組（CON組）、B7-H3組（B7-H3組）、肺炎鏈球菌組（SP組）、肺炎鏈球菌+B7-H3蛋白組（SP+B7-H3組）；每組12只小鼠。腹腔注射誘導(dǎo)麻醉后，通過側(cè)腦室定位注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液來建立小鼠細(xì)菌性腦膜炎模型；CON組注射15ul無菌生理鹽水，B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul無菌生理鹽水，SP組注入10ul無菌生理鹽水+5ul肺炎鏈球菌混懸液，SP+B7-H3組注入10ul濃度為0.33μg ul-1B7-H3蛋白+5ul肺炎鏈球菌混懸液。 2、分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h對(duì)各組小鼠進(jìn)行：1）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、2）記錄體質(zhì)量的變化（分別記錄注射前后在不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的體重，分析前后體重差值的變化）。研究B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞丟失（Nissl染色）和腦組織細(xì)胞凋亡（Tunel染色）的影響，評(píng)價(jià)腦損傷情況。關(guān)于動(dòng)物模型及分組同實(shí)驗(yàn)方法1.分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h檢測小鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的丟失和凋亡。(通過顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織中尼氏染色陽性細(xì)胞及凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量的改變）。 3、分析B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠腦組織勻漿中腦損傷標(biāo)志物NSE，S100b mRNA相對(duì)表達(dá)量及NSE,S100b,iNOS蛋白表達(dá)的影響，關(guān)于動(dòng)物模型及分組同實(shí)驗(yàn)方法1。分別于側(cè)腦室注射后18h、48h、72h對(duì)小鼠進(jìn)行1）Real-time PCR方法檢測腦組織勻漿中腦損傷標(biāo)志物NSE,S100b mRNA的相對(duì)表達(dá)量、2）免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織中NSE,S100b,iNOS蛋白的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠臨床癥狀的影響 1、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分：分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射后18h、48h、72h時(shí)的臨床評(píng)分。B7-H3組與CON組小鼠臨床評(píng)分：18h（5.0±0）vs（5.0±0）、48h（5.0±0）vs（5.0±0）、72h（5.0±0）vs（5.0±0），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP組在18h、48h、72h臨床評(píng)分較CON組均明顯降低：18h（4.5±0.57）vs（5.0±0）、48h（3.5±0.57）vs（5.0±0）、72h（2.75±0.5）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組在18h、48h、72h臨床評(píng)分均明顯低于CON組：18h（4.0±0）vs（5.0±0）、48h（3.0±0）vs（5.0±0）、72h（1.75±0.5）vs（5.0±0），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），且SP+B7-H3組與SP組相比進(jìn)一步降低：18h（4.0±0）vs（4.5±0.57）、48h（3.0±0）vs（3.5±0.57）、72h（1.75±0.5）vs（2.75±0.5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2、體質(zhì)量變化：分別記錄各組小鼠側(cè)腦室注射前和注射后18h、48h、72h體質(zhì)量的變化。B7-H3組與CON組小鼠在18h、48h、72h體質(zhì)量變化：18h（-0.01±0.24）vs（-0.05±0.42）、48h（-0.02±0.12）vs（-0.28±0.34）、72h（-0.02±0.13）vs（-0.07±0.4），兩組間體質(zhì)量變化無顯著差異（P0.05）；SP組接種細(xì)菌后18h、48h、72h時(shí)體重相對(duì)于CON組均降低：18h（0.8±0）vs（-0.05±0.42）、48h（1.48±0.05）vs（-0.28±0.34）、72h（2.53±0.07）vs（-0.07±0.4），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組小鼠在接種細(xì)菌和蛋白混懸液后體重明顯低于CON組：18h（1.5±0.17）vs（-0.05±0.42）、48h（2.0±0.02）vs（-0.28±0.34）、72h（3.23±0.12）vs（-0.07±0.4）（P0.05），SP+B7-H3組與SP組相比亦明顯降低：18h（1.5±0.17）vs（0.8±0）、48h（2.0±0.02）vs（1.48±0.05）、72h（3.23±0.12）vs（2.53±0.07），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 二、B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡的影響。 1、Nissl染色四組小鼠腦組織中均有染色陽性的細(xì)胞,在腦組織中，B7-H3組尼氏染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞與CON組比較無明顯差異18h（113.33±5.77）vs（115.0±5.0）、48h（113.0±1.0）vs（113.0±2.65）、72h（108.67±3.21）vs（107.67±3.21），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP組與CON組比較陽性細(xì)胞數(shù)量減少18h（105.0±5.0）vs（115.0±5.0）、48h（94.33±4.04）vs（113.0±2.65）、72h（89.33±0.58）vs（107.67±3.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組18h、48h、72h與CON組比較明顯降低18h（90.0±1.0）vs（115.0±5.0），48h（82.0±2.65）vs（113.0±2.65）、72h（81.33±2.31）vs（107.67±3.21），差異具有顯著性（P0.01）；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)SP+B7-H3組陽性細(xì)胞數(shù)目均低于SP組（90.0±1.0）vs（105.0±5.0）、（82.0±2.65）vs（94.33±4.04）、72h（81.33±2.31）vs（89.33±0.58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2、Tunel染色在腦組織中，B7-H3組Tunel染色陽性的凋亡細(xì)胞與CON組比較無明顯差異18h（0.67±0.57）vs（1.33±0.57）、48h（0.68±0.57）vs（0.67±0.58）、72h（1.0±1.0）vs（0.33±0.58），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP組與CON組比較凋亡細(xì)胞增多18h（11.33±1.53）vs（1.33±0.57）、48h（19.0±1.0）vs（0.67±0.58）、72h（26.32±1.54）vs（0.33±0.58），差異具有顯著性（P0.01）；SP+B7-H3組18h、48h、72h與CON組比較凋亡細(xì)胞增多更明顯18h（17.67±2.08）vs（1.33±0.57），48h（26.33±1.53）vs（0.67±0.58）、72h（38.0±2.65）vs（0.33±0.58），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)SP+B7-H3與SP組比較凋亡細(xì)胞亦增多18h（17.67±2.08）vs（11.33±1.53），48h（26.33±1.53）vs（19.0±1.0）、72h（38.00±2.65）vs（26.32±1.54）（P0.05）。 三、B7-H3對(duì)SP腦膜炎小鼠腦組織中腦損傷標(biāo)志物及iNOS的影響 1、Real-time PCR檢測腦組織勻漿中NSE，S100b mRNA的相對(duì)表達(dá)量：我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌注射18h、48h、72h后，B7-H3組和CON組的NSE mRNA表達(dá)，18h（0.052±0.034）vs（0.028±0.01）、48h（0.02±0.001）vs（0.028±0.003）、72h（0.036±0.002）vs（0.028±0.001），差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；細(xì)菌注射后18h時(shí)NSEmRNA相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組明顯升高（0.095±0.03）vs（0.028±0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）； SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.124±0.049）vs（0.095±0.03），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。細(xì)菌注射后48h時(shí)NSE mRNA相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組明顯升高（0.177±0.021）vs（0.028±0.003），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.33±0.088）v（s0.177±0.021），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；細(xì)菌注射后72h時(shí)NSE mRNA相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組明顯升高（0.369±0.035）v（s0.028±0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（0.529±0.02）vs（0.369±0.035），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 在細(xì)菌注射后B7-H3組和CON組的S100bmRNA表達(dá)，18h（0.04±0.018）vs（0.03±0.006）、48h（0.029±0.003）vs（0.029±0.002）、72h（0.048±0.001）vs（0.046±0.002），差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；細(xì)菌注射后18h時(shí)S100b mRNA相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組升高（0.061±.006）vs（0.03±0.006），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組升高（0.148±0.052）vs（0.061±.006），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；細(xì)菌注射后48h時(shí)S100b mRNA的相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組升高（0.185±0.012）vs（0.029±0.002），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組升高（0.194±0.018）vs（0.185±0.012），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；細(xì)菌注射后72h時(shí)S100b mRNA的相對(duì)表達(dá)量，SP組較CON組明顯升高（0.284±0.008）vs（0.046±0.002），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），SP+B7-H3組較SP組明顯升高（1.62±0.118）vs（0.284±0.008），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2、腦組織免疫組織化學(xué)結(jié)果分析： 2.1腦組織中NSE蛋白的表達(dá)：在腦組織中，各組小鼠均有NSE陽性細(xì)胞表達(dá)，光鏡下為胞內(nèi)基質(zhì)有棕褐色顆粒沉積。我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌注射后18h、48h、72h，B7-H3組與CON組比較NSE陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯差異：18h（100.0±4.58）vs（99.67±0.58）、48h（100.33±0.58）vs（99.66±2.08）、72h（99.67±2.31）vs（100.0±2.0），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P0.05）；SP組NSE陽性細(xì)胞數(shù)與CON組比較明顯減少18h（96.67±1.53）vs（99.67±0.58）、48h（82.0±2.65）vs（99.66±2.08）、72h（75.33±0.58）vs（100.0±2.0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。SP+B7-H3組NSE陽性細(xì)胞數(shù)與CON組比較在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯減少（86.67±2.89）vs（99.67±0.58）、（66.0±5.29）vs（99.66±2.08）、（55.0±5.0）vs（100.0±2.0），差異具有顯著性（P0.01）。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)SP+B7-H3組NSE陽性細(xì)胞數(shù)目均少于SP組（86.67±2.89）vs（96.67±1.53）、（66.0±5.29）vs（82.0±2.65）、（55.0±5.0）vs（75.33±0.58），差異具有顯著性（P0.05）。 2.2腦組織中S100b蛋白的表達(dá)：在腦組織中，各組小鼠均有S100b陽性細(xì)胞表達(dá)。在B7-H3組、CON組18h、48h、72h均出現(xiàn)S100b免疫組化反應(yīng)陽性，但陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異18h（23.45±1.98）vs（23.54±2.3）、48h（23.67±2.32）vs（23.53±2.12）、72h（23.78±2.34）vs（23.76±1.32）（P0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP組S100b表達(dá)較CON組明顯升高，18h（30.1±3.21）vs（23.54±2.3）、48h（38.23±3.23）vs（23.53±2.12）、72h（43.12±1.33）vs（23.76±1.32），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組S100b表達(dá)與CON組比較升高更明顯18h（40.6±1.45）vs（23.54±2.3）、48h（55.34±1.53）vs（23.53±2.12）、72h（68.12±2.89）vs（23.76±1.32），差異具有顯著性（P0.01）；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，SP+B7-H3組S100b表達(dá)均高于SP組，18h（40.6±1.45）vs（30.1±3.21）、48h（55.34±1.53）vs（38.23±3.23）、72h（68.12±2.89）vs（43.12±1.33），（P0.05）。 2.3腦組織中iNOS蛋白的表達(dá)：在腦組織中，用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照未見免疫組化iNOS陽性染色顆粒；B7-H3組與CON組幾乎都無iNOS的表達(dá)。SP組iNOS表達(dá)與CON組比較明顯升高，18h（29.33±1.15）vs（0.0±0.0）、48h（45.0±5.0）v（s1.0±0.0）、72h（71.67±2.89）v（s0.0±0.0），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；SP+B7-H3組iNOS表達(dá)較CON組升高更明顯，18h（35.33±0.58）vs（0.0±0.0）、48h（56.33±1.53）vs（1.0±0.0）、72h（81.67±2.89）vs（0.0±0.0），差異均具有顯著性（P0.01）；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，在18h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)SP+B7-H3組iNOS表達(dá)均高于SP組，18h（35.33±0.58）vs（29.33±1.15）、48h（56.33±1.53）vs（45.0±5.0）、72h（81.67±2.89）vs（71.67±2.89），差異均具有顯著性（P0.05）。 結(jié)論： 1、本實(shí)驗(yàn)經(jīng)側(cè)腦室注射肺炎鏈球菌混懸液，成功建立了小鼠SP腦膜炎模型。 2、本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在SP腦膜炎模型中，小鼠臨床評(píng)分降低，體重減輕，腦組織中Nissl染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞減少，Tunel染色陽性凋亡細(xì)胞增多；腦損傷標(biāo)志物分子NSE，S100b mRNA相對(duì)表達(dá)量及S100b，iNOS蛋白表達(dá)量升高，NSE蛋白陽性細(xì)胞在腦組織中減少，這些結(jié)果表明，SP腦膜炎小鼠模型發(fā)生了腦損傷。 3、協(xié)同信號(hào)分子B7-H3加劇了SP腦膜炎的臨床癥狀，促進(jìn)了腦組織神經(jīng)細(xì)胞丟失、凋亡（Nissl染色陽性的神經(jīng)元細(xì)胞減少更明顯，，Tunel染色陽性凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增多）；并且使NSE、S100bmRNA的相對(duì)表達(dá)量和S100b、iNOS蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，NSE蛋白陽性細(xì)胞進(jìn)一步減少，表明B7-H3加劇了SP腦膜炎引起的腦損傷。
【關(guān)鍵詞】：B7-H3 SP腦膜炎 NSE S100b iNOS 腦損傷
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R725.1
【目錄】：

• 中文摘要4-10
• Abstract10-18
• 引言18-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分 B7-H3 對(duì) SP 腦膜炎小鼠臨床癥狀（體質(zhì)量變化、神經(jīng)行為學(xué)改變）的影響23-30
• 材料與方法23-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-30
• 第二部分 B7-H3 對(duì) SP 腦膜炎小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞壞死（NISSL 染色）和凋亡（TUNEL 染色）的影響30-40
• 材料與方法30-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 第三部分 B7-H3 對(duì) SP 腦膜炎小鼠腦組織中腦損傷標(biāo)志物 NSE、S100B 及 INOS 的影響40-55
• 材料與方法40-46
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-55
• 討論55-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)論68-69
• 綜述69-77
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 中英文對(duì)照縮略詞表77-78
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文78-79
• 本課題支助項(xiàng)目79-80
• 致謝80-81

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 趙建祥;賀華;馬建芳;卞留貫;孫青芳;沈建康;;饑餓誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬發(fā)生及Beclin-1表達(dá)的變化[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年09期

2 陳仁輝,李永宏,蔡紅星,吳茂旺,汪楓;大鼠彌漫性腦損傷后早期病理學(xué)及烯醇化酶表達(dá)[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

3 曹旭東,孔令洪,王一理;B7家族新成員[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2003年04期

4 洪遠(yuǎn);郭松雪;張建民;;自噬在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用[J];中國病理生理雜志;2011年08期

5 谷興華;張供;張希全;宋毅;王濤;李守先;;血清蛋白B亞型和神經(jīng)元特異性烯醇化酶對(duì)早期判斷體外循環(huán)術(shù)后腦損傷的意義[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年14期

6 杜鵬;木依提;欒新平;賈宏宇;苑楊;徐敬軒;張晶晶;;外傷性癲癇模型海馬中自噬變化動(dòng)態(tài)研究[J];新疆醫(yī)學(xué);2013年09期

本文編號(hào)：747510