本文關(guān)鍵詞：IL-11調(diào)控壞死性小腸結(jié)腸炎腸上皮細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制研究

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【摘要】：世界范圍報(bào)道的壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotising enterocolitis, NEC)在活產(chǎn)兒中發(fā)病率為1‰-3‰,極低出生體重的早產(chǎn)兒發(fā)病率為10%,且88%的病例發(fā)生于胎齡小于32周的極早產(chǎn)兒,是影響早產(chǎn)兒存活及遠(yuǎn)期預(yù)后的重要疾病,其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。最近,越來越多的研究表明,多種細(xì)胞因子及其介導(dǎo)的信號途徑在NEC患兒系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中起重要作用。但這些研究多數(shù)關(guān)注促炎細(xì)胞因子,有關(guān)保護(hù)性的細(xì)胞因子方面的報(bào)道較少。研究證實(shí),白細(xì)胞介素-11(interleukin-11, IL-11)在多種原因致腸損傷時(shí),可發(fā)揮抗凋亡、促增殖、下調(diào)促炎因子、營養(yǎng)腸細(xì)胞等保護(hù)作用。本基金課題前期研究表明：早產(chǎn)兒外周血清IL-11(內(nèi)源性)水平與胎齡呈正相關(guān),且在NEC時(shí)反應(yīng)性上調(diào),參與了早產(chǎn)兒NEC病變過程。盡管機(jī)體在NEC時(shí)也有保護(hù)性的反應(yīng),但NEC時(shí)病情往往進(jìn)展迅速,死亡風(fēng)險(xiǎn)極高,可能為不成熟的機(jī)體在應(yīng)對刺激時(shí),機(jī)體的促炎與抗炎等反面仍處于失衡狀態(tài),難以對抗病情的進(jìn)展。因此,開展深入研究來嘗試應(yīng)用外源性保護(hù)因子來促進(jìn)NEC病變恢復(fù),將為闡明NEC分子機(jī)制及診治、治療提供新的思路。 IL-11是1990年P(guān)aul等通過對靈長類骨髓的基質(zhì)細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)的多效能細(xì)胞因子。IL-11不僅對造血系統(tǒng)具有廣泛的生物學(xué)活性,近年來還發(fā)現(xiàn)IL-11對非造血系統(tǒng)也有影響。尤其是通過參與細(xì)胞生理調(diào)控對多種原因造成的腸上皮損傷具有保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)作用。 已有研究表明,IL-11參與了早產(chǎn)NEC患兒的內(nèi)源性細(xì)胞因子反應(yīng)。Nadler等研究發(fā)現(xiàn),IL-11mRNA在急性期NEC患兒腸組織中適應(yīng)性上調(diào),這種反應(yīng)能減少NEC損傷的程度,提示IL-11mRNA表達(dá)與NEC的病變程度呈負(fù)相關(guān)。Dickinson等研究發(fā)現(xiàn),在腸壞死范圍較廣的NEC患兒或腸造瘺術(shù)后患兒中,外源性應(yīng)用IL-11可預(yù)防黏膜萎縮和腸縮短,因此有助于減少重癥NEC患兒短腸綜合征發(fā)生。這些研究提示IL-11在NEC中為起保護(hù)性作用的細(xì)胞因子,并對NEC遠(yuǎn)期并發(fā)癥具有一定預(yù)防作用。但這些報(bào)道均未涉及外源性應(yīng)用IL-11影響NEC病變發(fā)生發(fā)展規(guī)律的系統(tǒng)性研究。 IL-11可誘導(dǎo)的Jak/STAT (Janus Kinase/Signal transducer and activator of transcription, Jak/STAT)等三條主要信號通路,在維持腸道病理生理穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子表達(dá)及細(xì)胞增殖與凋亡中均具有重要作用。在Jak/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中STAT3扮演著重要的角色,活化的STAT3可以誘導(dǎo)一系列基因的表達(dá),對細(xì)胞的增殖與凋亡起重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明IL-11與IL-11Ra特異性地結(jié)合形成復(fù)合物,繼而使JAK激酶酪氨酸磷酸化活化,從而使STAT和受體磷酸化,形成STAT1-STAT3后發(fā)生核轉(zhuǎn)位,調(diào)節(jié)其通路下游靶基因的表達(dá)。王瑞娟等發(fā)現(xiàn)IL-11可激活Jak/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)Bcl-2,同時(shí)下調(diào)Bax表達(dá),起到抗凋亡的作用,促進(jìn)腸隱窩上皮再生,保護(hù)放射性腸上皮損傷作用。本研究的前期發(fā)現(xiàn),1、IL-11對新生大鼠NEC模型具有一定保護(hù)作用,能減輕腸炎,促進(jìn)腸道病理形態(tài)改變,延長動物存活時(shí)間等。但對其保護(hù)機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。Bax、Bel-2、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell neucleus antigen, PCNA)是調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的重要分子,既往研究發(fā)現(xiàn)IL-11能夠通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2等蛋白的表達(dá),從而減輕中子輻射所致的腸道損傷；IL-11可通過上調(diào)PCNA表達(dá)促進(jìn)放化療小鼠腸隱窩細(xì)胞增殖。NEC時(shí)腸道重要的病理損傷為壞死和凋亡,腸道修復(fù)需要隱窩上皮細(xì)胞增殖分化來完成。為此,我們推測,IL-11在NEC時(shí)保護(hù)作用可能與對增殖與凋亡相關(guān)分子有關(guān)。2、本基金課題前期通過脂多糖(LPS)作用于正常大鼠空腸上皮細(xì)胞系(intestinal epithelial cellNo.6,IEC-6),建立了NEC體外模型,LPS處理后,凋亡率增加,增殖活力下降,通過外源性IL-11處理,能減輕IEC-6細(xì)胞凋亡,促進(jìn)其增殖。為進(jìn)一步闡明NEC時(shí)IL-11的腸道保護(hù)作用,并闡明其可能發(fā)生的機(jī)制,為新的防治措施奠定理論基礎(chǔ)。 研究方法 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 通過LPS、缺氧和喂養(yǎng)乳鼠替代品人工喂養(yǎng)新生大鼠,復(fù)制NEC模型,并通過應(yīng)用IL-11建立治療模型。實(shí)驗(yàn)分為對照組、NEC組和IL-11治療組。 1、采用HE染色技術(shù),觀察IL-11對大鼠腸道上皮細(xì)胞病理形態(tài)改變影響。 2、采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),檢測IL-11對大鼠腸道上皮細(xì)胞凋亡的影響。 3、采用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究IL-11對大鼠腸道上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2和PCNA表達(dá)變化的影響。 二、體外實(shí)驗(yàn) 通過LPS作用于正常IEC-6細(xì)胞,復(fù)制NEC體外模型,并通過應(yīng)用IL-11建立體外處理模型。實(shí)驗(yàn)分為對照組、LPS組、IL-11處理組。采用免疫印跡方法研究IL-11對大鼠腸道上皮細(xì)胞磷酸化STAT3、Bax、Bcl-2及PCNA蛋白含量的表達(dá)變化影響。 三、圖像分析與定量 在顯微鏡高倍視野下(400×)：1、每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)視野,用CMIAS-Ⅰ病理圖像分析系統(tǒng),測定Bax、Bcl-2及PCNA表達(dá)的平均光密度(MOD)；2、測定各組IEC-6細(xì)胞P-STAT、Bax、Bcl-2及PCNA表達(dá)目的條帶的相對灰度值,并進(jìn)行定量分析。 四、統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采取one-Way-ANOVA方差分析,用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 研究結(jié)果 一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1、新生大鼠腸道損傷的病理變化 從腸道病理形態(tài)上看,正常新生大鼠的小腸絨毛整齊,腸隱窩數(shù)量較多,且形態(tài)較好；NEC3天時(shí),可見大鼠小腸組織絨毛壞死脫落,呈禿狀,隱窩數(shù)量少、結(jié)構(gòu)破壞；此時(shí)IL-11治療組大鼠小腸上皮細(xì)胞仍有腫脹表現(xiàn),但程度較NEC組輕。結(jié)腸的損傷與小腸具有相似的病理改變。 2、新生大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡變化 正常腸上皮細(xì)胞核呈弱陽性表達(dá)；NEC組中上述部位細(xì)胞核呈陽性表達(dá)；IL-11治療組中陽性細(xì)胞核量較NEC組少,但仍強(qiáng)于正常對照組。 3、新生大鼠腸組織中Bax的表達(dá)變化 Bax在正常腸絨毛及隱窩上皮細(xì)胞漿呈弱陽性表達(dá)；NEC組中Bax在腸道表達(dá)顯著增強(qiáng)；IL-11治療組中表達(dá)較NEC組減弱,但仍強(qiáng)于正常對照組。定量分析結(jié)果表明,NEC時(shí)腸組織中Bax表達(dá)增加,IL-11能顯著下調(diào)腸組織中Bax的表達(dá)。 4、新生大鼠腸組織中Bcl-2的表達(dá)變化 Bcl-2在正常腸絨毛及隱窩上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈陽性表達(dá)；NEC組中Bcl-2在腸道表達(dá)顯著降低；IL-11治療組中表達(dá)較NEC組增強(qiáng),但強(qiáng)度不如正常對照組。定量分析結(jié)果表明,NEC時(shí)腸組織中Bcl-2表達(dá)下降,IL-11能顯著上調(diào)腸組織中Bcl-2的表達(dá)。 5、新生大鼠腸組織中PCNA的表達(dá)變化 PCNA在正常腸絨毛及隱窩上皮細(xì)胞核呈強(qiáng)陽性表達(dá)；NEC組中PCNA在腸道表達(dá)顯著降低,呈弱陽性；IL-11治療組中表達(dá)較NEC組增強(qiáng),但強(qiáng)度不如正常對照組。定量分析結(jié)果表明,NEC時(shí)腸組織中PCNA表達(dá)下降,IL-11可上調(diào)腸組織中PCNA表達(dá)。 二、體外實(shí)驗(yàn) 1、細(xì)胞形態(tài)的變化 LPS組中IEC-6細(xì)胞由原來的“石子路”狀態(tài)變圓,間隙增大；加入IL-11處理后,細(xì)胞狀態(tài)較原來有所改善,呈多角形,間隙增大。 2、IEC-6細(xì)胞磷酸化STAT3蛋白含量的表達(dá)變化 正常IEC-6細(xì)胞中存在基礎(chǔ)性STAT3磷酸化活化；在LPS組P-STAT3蛋白表達(dá)明顯減少；IL-11處理后其表達(dá)較LPS組顯著增多,但仍低于正常對照組。定量分析結(jié)果表明,NEC時(shí)STAT3磷酸化活化受抑制,IL-11處理能增加磷酸化STAT3活化。 3、IEC-6細(xì)胞Bax蛋白含量的表達(dá)變化 正常IEC-6細(xì)胞表達(dá)一定量的Bax蛋白；LPS組顯著增高；IL-I1處理組Bax蛋白含量較LPS組顯著減少,但仍高于正常對照組。定量分析結(jié)果表明,LPS致IEC-6細(xì)胞損傷時(shí),Bax表達(dá)增強(qiáng),IL-11處理可抑制Bax的表達(dá)。 4、IEC-6細(xì)胞Bcl-2蛋白含量的表達(dá)變化 正常IEC-6細(xì)胞表達(dá)一定量Bcl-2蛋白；LPS組其蛋白含量顯著減少；IL-11處理組中Bcl-2蛋白較LPS組顯著增加,但仍低于正常對照組。定量分析結(jié)果表明,LPS致IEC-6細(xì)胞損傷時(shí),Bcl-2表達(dá)減弱,IL-1l處理可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。 5、IEC-6細(xì)胞PCNA蛋白含量的表達(dá)變化 正常IEC-6細(xì)胞表達(dá)一定量PCNA蛋白；LPS組中其含量顯著減少；IL-11治療組PCNA蛋白較LPS組顯著增加,但仍低于正常對照組。定量分析結(jié)果表明,LPS致IEC-6細(xì)胞損傷時(shí),PCNA表達(dá)下降,IL-11處理可上調(diào)PCNA表達(dá)。 結(jié)論 一、NEC時(shí)腸道細(xì)胞凋亡增加,應(yīng)用外源性IL-11治療能減輕腸道損傷,促進(jìn)腸道修復(fù)。其機(jī)制與IL-11上調(diào)Bcl-2、PCNA表達(dá),并下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)。 二、LPS致IEC-6細(xì)胞損傷時(shí),應(yīng)用IL-11對IEC-6細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能與激活Jak/STAT信號通路中關(guān)鍵分子STAT3,繼而上調(diào)Bcl-2、PCNA,下調(diào)Bax有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：IL-11 NEC P-STAT3 Bax Bcl-2 PCNA
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.7
【目錄】：

• 摘要4-10
• ABSTRACT10-17
• 引言17-23
• 參考文獻(xiàn)20-23
• 第一部分23-50
• 1.1 材料與方法24-31
• 1.2 結(jié)果31-44
• 1.3 討論44-47
• 1.4 結(jié)論47
• 1.5 參考文獻(xiàn)47-50
• 第二部分50-75
• 2.1 材料與方法51-62
• 2.2 結(jié)果62-68
• 2.3 討論68-71
• 2.4 結(jié)論71
• 2.5 參考文獻(xiàn)71-75
• 全文結(jié)論75-76
• 附錄76-77
• 攻讀學(xué)位期間成果77-78
• 致謝78-80
• 綜述80-87
• 參考文獻(xiàn)85-87

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：738084