本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型P1蛋白鼠源性單克隆抗體的鑒定及腸道病毒71型快速VP1-ELISA中和實驗的建立

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【摘要】：手足口病(hand, foot, and mouth disease, HFMD)是一種以發(fā)熱及手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹為主要的臨床特征的兒童常見傳染病。絕大部分兒童感染后的病情較輕,但少部分患兒會出現(xiàn)比較嚴(yán)重的神經(jīng)、呼吸和循環(huán)系統(tǒng)的并發(fā)癥,甚至死亡。近幾十年在亞太地區(qū)頻繁暴發(fā)高致病性和高死亡率的手足口病疫情,已成為嚴(yán)重威脅兒童健康的一種疾病。研究表明近幾十年引起手足口病疫情的主要病原是腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)及柯薩奇A16病毒(Coxsachievirus A16, Cox A16),由于EV71具有中樞神經(jīng)親嗜性,部分EV71感染患者會出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥(無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫等)以及全身性并發(fā)癥(多器官衰竭、休克、DIC等),是手足口病的主要致死原因,因而EV71成為科學(xué)家研究的熱點。EV71屬小核糖核酸病毒科,病毒由四種衣殼蛋白(VP1-VP4)組成的衣殼包裹RNA核心所構(gòu)成。VP1、VP2和VP3衣殼蛋白位于病毒衣殼的外表面,因而病毒的中和表位主要位于這三個蛋白上。VP4蛋白位于病毒表面內(nèi)側(cè),可能與維持病毒結(jié)構(gòu)有關(guān),尚無中和表位發(fā)現(xiàn)。由于VP1和VP4基因相對保守,目前按VP1和(或)VP4基因?qū)V71病毒進行分型,分A, B1-B5、C1-C5,共11個基因亞型,中國大陸自1997年后只有C4亞型流行。 目前針對腸道病毒EV71感染尚無有效的預(yù)防治療藥物,因而尋求預(yù)防和治療EV71感染的藥物和研制EV71疫苗正成為國內(nèi)外學(xué)者共同關(guān)注的課題。臨床研究表明給予患者輸注免疫球蛋白可以改善病情。但是輸注免疫球蛋白存在感染血液傳染病的風(fēng)險,并且商品化的免疫球蛋白很難保障批次間質(zhì)量的一致性。使用高中和活性的單抗可以避免這些問題。因而制備高中和活性的EV71單抗可以為EV71治療提供新的思路。由于EV71感染所致的重癥手足口病會留下后遺癥,所以開發(fā)EV71疫苗是目前控制EV71疫情,減少疾病死亡率、致殘率的最佳策略。誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生的能力是評價疫苗的效果的重要指標(biāo)。目前在EV71研究中公認(rèn)的中和實驗方法是基于細(xì)胞病變的中和實驗(cytopathic effect based microneutralization test, CPE-MNT),這種方法存在耗時耗力,結(jié)果不夠客觀等缺陷,不適合用于大批量檢測。因而亟需建立簡便、快速、客觀的適合高通量檢測的新方法。 前期我們實驗室以EV71病毒(C4亞型)和重組VP4蛋白為抗原免疫小鼠,通過雜交瘤細(xì)胞法制備了一批針對EV71的抗體。為進一步明確這些單抗所針對的靶標(biāo),采用酵母展示技術(shù)構(gòu)建了分別表達(dá)VP1、VP2、VP3和VP4蛋白的重組酵母,鑒定出一組針對EV71衣殼蛋白的單抗；利用經(jīng)典中和實驗篩選出具有中和活性的EV71單克隆抗體；另外我們建立了一種基于ELISA檢測的簡便、快速、客觀的高通量的EV71中和實驗方法。進而為研究EV71病毒衣殼的抗原結(jié)構(gòu)及功能以及疫苗制備提供實驗依據(jù)。研究內(nèi)容包含三個部分： 第一部分：酵母展示技術(shù)表達(dá)EV71的四種衣殼蛋白 酵母表面展示技術(shù)以其較為完善的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和分泌機制、安全無毒等獨特的優(yōu)越性,近年來頗受關(guān)注,已成為蛋白質(zhì)工程研究的功能平臺。本研究應(yīng)用pYD1EBY100酵母展示系統(tǒng)將EV71的VP1、VP2、VP3和VP4四種衣殼蛋白展示在EBY100釀酒酵母表面：根據(jù)EV71(GZR)基因序列信息設(shè)計引物,經(jīng)PCR擴增獲得VP1、VP2、VP3和VP4基因片段,利用雙酶切和連接將目的片段定向插入到pYD1質(zhì)粒中,構(gòu)建了重組的VP1-pYD1、VP2-pYD1、VP3-pYD1和VP4-pYD1重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到EBY100釀酒酵母中,在半乳糖的誘導(dǎo)下目的蛋白以"Xpress-目的蛋白-6xHis"融合蛋白形式在酵母表面表達(dá)。用Xpress單抗或His單抗檢測目的蛋白的表達(dá)情況,在誘導(dǎo)后48h,50-60%酵母細(xì)胞表面可檢測到目的蛋白的表達(dá),之后陽性酵母所占比例不再升高。我們應(yīng)用48h誘導(dǎo)的這些重組酵母建立了基于流式檢測的單抗鑒定方法。由于酵母展示的蛋白接近天然蛋白,整個檢測過程不會使蛋白變性,因而理論上該方法不僅可以鑒定識別線性表位的EV71單抗,還可以鑒定識別構(gòu)象表位的單抗。 第二部分：腸道病毒71型P1蛋白單克隆抗體的鑒定 為明確前期我們實驗室制備的20株EV71單克隆抗體所針對的抗原,本文應(yīng)用免疫熒光(immunofluorescent assay,IFA)，免疫印跡和酵母展示技術(shù)聯(lián)合流式檢測方法對單抗進行鑒定。我們復(fù)蘇凍存的雜交瘤細(xì)胞,接種到小鼠腹腔制備EV71單抗的腹水,采用辛酸-硫酸銨沉淀法進行對抗體進行純化。隨后采用免疫熒光、免疫印跡和第一部分所建立的流式鑒定方法對這些單抗進行鑒定。IFA檢測顯示所有的20株單抗均能與EV71感染細(xì)胞結(jié)合,而不與正常細(xì)胞反應(yīng),提示這些單抗是特異性EV71單抗；在免疫印跡檢測中,5株單抗(M-5、M-8、M-12、M-14、M-18)與VP1重組蛋白特異性結(jié)合,3株單抗(M-3、M-10、M-13)與VP2重組蛋白特異性結(jié)合,1株單抗(M-1)與VP4重組蛋白特異性結(jié)合,提示這些單抗是識別相應(yīng)蛋白的單克隆抗體,它們均識別線性表位。在流式檢測中,4株單抗(M-5、M-8、M-14、M-26)與VP1重組酵母特異性結(jié)合,3株單抗(M-3、M-10、M-13)與VP2重組酵母特異性結(jié)合,1株單抗(M-1)與VP4重組蛋白特異性結(jié)合,M-12與VP1重組酵母及VP2重組酵母均有結(jié)合,M18與四種重組酵母均不結(jié)合；流式與免疫印跡兩種方法對7株單抗鑒定的結(jié)果一致,3株單抗的鑒定結(jié)果有出入。M-26可特異性與VP1重組酵母結(jié)合,而在免疫印跡中它不與重組的VP1蛋白結(jié)合,說明該抗體可能針對天然VP1蛋白上的構(gòu)象型表位。M-18與VP1重組蛋白結(jié)合的,而不與VP1重組酵母結(jié)合,可能該抗體識別的線性表位位于天然蛋白的內(nèi)部。令人疑惑的是M-12單抗與VP1和VP2重組酵母均可結(jié)合,而僅與重組VP1蛋白結(jié)合,具體原因還有待進行一步研究。用經(jīng)典的CPE-MNT測定這20株單抗對EV71的中和活性,共篩選到3株有中和活性的單抗,均為VP1單抗。其中2株中和活性較強的EV71單抗,可作為候選的治療性EV71單抗應(yīng)用。 第三部分：腸道病毒71型快速VP1-ELISA中和實驗的建立參考文獻,我們建立了一種基于ELISA檢測的EV71VP1蛋白的中和實驗方法,ELISA中和實驗(ELISA based microneutralization test, ELISA-MNT),其基本原理是：VP1蛋白是EV71病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,EV71感染細(xì)胞后合成VP1蛋白與病毒的增殖呈正相關(guān)。將感染EV71的細(xì)胞進行固定,再利用抗VP1的單抗進行直接ELISA檢測病毒對細(xì)胞的感染情況。本研究以人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(Rhabdomyosarcoma Cell, RD)為病毒感染靶細(xì)胞,通過優(yōu)化感染病毒量和檢測抗體濃度,建立了感染24h后快速檢測的ELISA-MNT.實驗步驟如下：將系列稀釋的抗體或血清與等量的1：1000稀釋病毒液(3.16×104TCID50)孵育1小時,感染24h后固定細(xì)胞,以VP1單抗(AC17B6-HRP)進行ELISA檢測,以抗體或者血清檢測孔中A450值小于0.5倍病毒對照孔A450的抗體或者血清最高稀釋度作為抗體或血清的中和效價,中和效價10認(rèn)為具有中和活性,反之無。我們以CPE-MNT為金標(biāo)準(zhǔn),對ELISA-MNT進行評估。兩種方法分別測定20株EV71單抗和19份人血清的中和活性,結(jié)果顯示ELISA-MNT的靈敏度為92.9%,特異度為100%。具有中和活性的3株單抗和10份血清的中和滴度檢測結(jié)果顯示兩種方法測定中和抗體滴度的相關(guān)性良好(r=0.934,P0.001)。此外,ELISA-MNT方法較CPE-MNT相比,時間大大縮短(2天完成檢測)。綜上所述我們所建立的這種ELISA-MNT方法,省時省力,適合高通量檢測EV71中和抗體。 小結(jié)： 根據(jù)以上三個部分的研究,本研究小結(jié)如下： 1.構(gòu)建了EV71衣殼蛋白酵母展示系統(tǒng),成功地獲得了能表達(dá)EV71衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的重組酵母菌。利用重組酵母菌建立了鑒定EV71單抗的流式檢測方法,為鑒定EV71P1蛋白的單抗,特別是識別構(gòu)象表位的P1單抗建立了良好的實驗平臺。 2.應(yīng)用IFA、免疫印跡、酵母展示技術(shù)聯(lián)合流式檢測方法鑒定了前期制備的20株鼠源性EV71單克隆抗體,鑒定出6株VP1單抗,3株VP2單抗,1株VP4單抗。 3.免疫印跡與酵母展示技術(shù)聯(lián)合流式檢測方法鑒定單抗的結(jié)果一致性較好。 4.獲得三株具有較強的中和活性的EV71VP1單抗M-5、M-8和M-14,有望作為候選的治療性單抗應(yīng)用。 5.建立了一種EV71快速VP1-ELISA中和實驗。以CPE方法作為金標(biāo)準(zhǔn),該方法具有較好的靈敏性(92.9%)和特異性(100%)。該方法與傳統(tǒng)的細(xì)胞病變中和實驗的有良好的相關(guān)性。該方法檢測快速、結(jié)果客觀,適于高通檢測EV71中和抗體。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型(EV71) 衣殼蛋白 酵母表面展示 單克隆抗體 中和實驗 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-25
• 第一章 酵母展示技術(shù)表達(dá)EV71四種衣殼蛋白25-39
• 1 材料和方法25-34
• 2 結(jié)果34-38
• 3 討論38-39
• 第二章 腸道病毒71型P1蛋白單克隆抗體的鑒定39-55
• 1 材料和方法39-46
• 2 結(jié)果46-53
• 3 討論53-55
• 第三章 腸道病毒71型快速VP1-ELISA中和實驗的建立55-69
• 1 材料和方法55-61
• 2 結(jié)果61-67
• 3 討論67-69
• 全文小結(jié)69-70
• 參考文獻70-77
• 綜述77-87
• 參考文獻84-87
• 縮寫詞簡表87-89
• 研究期間所發(fā)表論文情況89-90
• 致謝90-91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：713469