本文關(guān)鍵詞：1.中國廣州地區(qū)G6PD缺乏癥男性患兒的遺傳學(xué)分析 2.G6PD基因與早期不明原因流產(chǎn)的關(guān)系探討

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【摘要】：第一部分 中國廣州地區(qū)G6PD缺乏癥男性患兒的遺傳學(xué)分析葡萄糖6磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是紅細(xì)胞磷酸戊糖途徑中的關(guān)鍵酶,該途徑能產(chǎn)生NADPH(還原型輔酶Ⅱ)以保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化物質(zhì)的損傷。而葡萄糖6磷酸脫氫酶缺乏癥[OMIM:305900](G6PD缺乏癥)是一種X連鎖不完全顯性的酶缺乏癥,全球范圍內(nèi)約有4億人受累,尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)高發(fā)。在中國,G6PD缺乏癥呈“南高北低”的分布趨勢,主要集中在長江以南的地區(qū),包括廣東、廣西、海南、云南等省份。該病臨床癥狀多樣,男性半合子G6PD活性呈顯著性下降,而女性雜合子酶活性變化范圍則較大,可呈顯著性降低,也可在正常范圍,因此我們選擇了臨床癥狀較統(tǒng)一的男性半合子做為研究對象。G6PD缺乏癥大多由G6PD基因突變引起。該基因是一種看家基因,位于X染色體長臂(Xq28),長23182bp,含13個外顯子和12個內(nèi)含子,酶分子含545個氨基酸殘基。截至2016年,在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database,HGMD)中查到的G6PD缺乏癥致病基因總數(shù)為209種,其中錯義突變及無義突變191種、基因調(diào)控區(qū)突變1種、剪切突變3種、小片段缺失10種、小片段插入2種、較大片段缺失2種。致病性突變可以導(dǎo)致G6PD活性水平降低,使紅細(xì)胞容易受到外源性氧化劑攻擊而引發(fā)損傷,進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解引起急性溶血性貧血。有報道顯示,在G6PD缺乏癥的高發(fā)地區(qū),有近1/3的新生兒溶血是由G6PD缺乏引起的�？紤]到不同的基因型所導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)不同,因此研究不同基因突變型的基因表達(dá)量及G6PD酶活性之間的相關(guān)性將有利于更深入地研究G6PD缺乏癥的發(fā)病機(jī)制。中國人的G6PD缺乏癥基因突變類型主要以c.1388 GA(G6PD Kaiping)、c.1376GT(G6PD Canton)、c.95 AG(G6PD Gaohe)、c.871GA(G6PD Viangchan)等錯義突變?yōu)橹?其中前兩種基因型在中國常見基因型中占主要比例,均大于30%。因此,本研究通過構(gòu)建G6PD基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于比較中國人群中常見的兩種基因型(c.1376GT,c.1388GA)在酶活性和逆轉(zhuǎn)錄水平上的相關(guān)性。另外,G6PD基因11號外顯子上c.1311CT的突變在中國人群中也十分常見,但是對于該突變是否致病仍存在爭議。該基因突變常與IVSXI+93TC及rs1050757G呈連鎖不平衡,以單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的基因型被檢出,是由同義突變及SNPs組成。但有研究認(rèn)為在亞洲人口中檢測出該種單倍型與G6PD酶活性下降有一定的相關(guān)性。為證實此單倍型是否致病,本文欲通過對其c DNA的研究去分析G6PD單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G是否因剪切突變而引起G6PD酶活性缺乏。[目的]:通過G6PD基因絕對定量法研究中國廣東地區(qū)男性兒童常見突變基因型間表型及轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系,并通過對單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G標(biāo)本的c DNA測序分析,比對是否存在剪切位點(diǎn)改變進(jìn)而引發(fā)疾病的可能。[方法]:收集正常對照及G6PD缺乏癥患兒的血液標(biāo)本共203例,提取其DNA進(jìn)行基因型分析。將單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的c DNA標(biāo)本和正常對照進(jìn)行直接測序分析,并應(yīng)用Cluster軟件比對兩者之間是否存在剪切位點(diǎn)的差異。另外對所有受試者的c DNA采用實時熒光定量PCR檢測其G6PD基因表達(dá)量。用SPSS20.0版軟件統(tǒng)計各基因型間表達(dá)量及酶活性比值的差異,并通過Western blot方法驗證得到的表達(dá)量結(jié)果。以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。[結(jié)果]:正常對照與G6PD缺乏癥患兒(男孩)的G6PD基因表達(dá)量間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);不同基因型間(c.1376GT,c.1388GA及其他基因型)G6PD酶活性差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但不同G6PD基因型間的基因表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在10例單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/rs1050757G的標(biāo)本中有8例檢出了已知的致病性突變,但這10例均未發(fā)現(xiàn)剪切錯誤。[結(jié)論]:我們的實驗結(jié)果不支持G6PD單倍型c.1311CT/IVSXI+93 TC/r s1050757G由于剪切而致病的推斷。G6PD缺乏癥患者較正常人的G6PD基因表達(dá)量有顯著性降低,而基因型為G6PD c.1376 GT的患者會比c.1388 GA產(chǎn)生更為嚴(yán)重的臨床表型。第二部分G6PD基因與早期不明原因流產(chǎn)的關(guān)系探討早期自然流產(chǎn)是常見的病理性妊娠,其發(fā)生率在國內(nèi)外均較高。目前,臨床上有近半數(shù)的流產(chǎn)原因為染色體異常,而基因芯片的廣泛應(yīng)用為排除染色體異常所導(dǎo)致的自然流產(chǎn)提供了一個快捷的診斷平臺,但仍有很多不明原因的自然流產(chǎn)存在。因此,對早期不明原因流產(chǎn)的根源研究仍需我們進(jìn)一步探索。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥[OMIM:+305900]是一組最常見的人類酶缺陷綜合征,全球范圍內(nèi)約有4億人受累,尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)高發(fā)。在中國,G6PD缺乏癥主要在廣東、廣西等南方地區(qū)高發(fā)。G6PD是磷酸戊糖途徑的一個限速酶,它可以將G6P轉(zhuǎn)變?yōu)?PG而伴隨產(chǎn)生NADPH,而NADPH是體內(nèi)維持氧化平衡的重要物質(zhì)。因為G6PD缺乏癥主要引發(fā)溶血性疾病(如新生兒溶血性貧血等),所以過往相關(guān)研究多集中于紅細(xì)胞,但近年來越來越多的證據(jù)表明,G6PD缺乏癥也會影響有核細(xì)胞的病理生理過程,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞衰老、增強(qiáng)細(xì)胞對病毒感染的敏感性而損害胚胎發(fā)育等等。同時,在以往的流行病學(xué)篩查中,G6PD基因的突變以點(diǎn)突變?yōu)槎?并未發(fā)現(xiàn)大的缺失及移碼突變,我們好奇這些未發(fā)現(xiàn)過的突變是否為致死性突變而引起負(fù)性自然選擇?本文欲篩查不明原因流產(chǎn)絨毛標(biāo)本中是否存在G6PD基因的大片段缺失及移碼突變,然后與人工流產(chǎn)的絨毛標(biāo)本基因測序結(jié)果相比較,通過本次研究探索G6PD基因與人類胚胎早期發(fā)育的關(guān)系,為臨床上早期不明原因的自然流產(chǎn)尋找線索。[目的]:探討G6PD基因與早期不明原因流產(chǎn)的關(guān)系。[方法]:對56例不明原因流產(chǎn)絨毛標(biāo)本及30例正常絨毛標(biāo)本進(jìn)行G6PD基因測序。通過統(tǒng)計學(xué)分析(卡方檢驗)比較兩組間的突變率差異。[結(jié)果]:在56例不明原因流產(chǎn)的絨毛標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)20例(33.9%)SNP,其中11例(19.6%)為c.1311CT/IVS XI+93TC單倍體型、6例(10.7%)為rs3216174、1例(1.8%)為rs200111236、1例(1.8%)為rs200729823;并發(fā)現(xiàn)1例(1.8%)錯義突變,為c.1024CT。在30例正常絨毛標(biāo)本中僅發(fā)現(xiàn)4例SNP(13.3%),均為c.1311CT/IVS XI+93TC單倍體型。兩組SNP頻率比較差異有顯著性(χ2=4.86,P0.05)。[結(jié)論]:本研究在56例不明原因流產(chǎn)的病例中,發(fā)現(xiàn)存在較高頻率的G6PD基因SNP位點(diǎn),但未發(fā)現(xiàn)有移碼突變和大片段缺失的病例標(biāo)本。
【關(guān)鍵詞】：G6PD缺乏癥 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR 絕對定量 基因型 基因表達(dá)量 G6PD 不明原因流產(chǎn) 絨毛
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.8
【目錄】：

• 第一部分中文摘要3-5
• 第一部分英文摘要5-8
• 第二部分中文摘要8-10
• 第二部分英文摘要10-14
• 第一部分 中國廣東地區(qū)G6PD缺乏癥男性患兒的遺傳學(xué)分析14-46
• 引言14-17
• 第一章 實驗材料17-20
• 1.1 研究對象17
• 1.2 主要試劑17-19
• 1.3 主要實驗儀器19-20
• 第二章 實驗方法20-30
• 2.1 基因組DNA、RNA、cDNA的制備20-21
• 2.2 基因型檢測21-22
• 2.3 剪接位點(diǎn)的比對22-23
• 2.4 G6PD基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立23-26
• 2.5 BIO-RAD熒光定量檢測26-27
• 2.6 G6PD基因的Western blot27-28
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析28-30
• 第三章 實驗結(jié)果30-39
• 3.1 基因分型結(jié)果30
• 3.2 G6PD單倍型c.1311C>T/IVS+1193T>C/rs1050757cDNA剪切點(diǎn)比對30-35
• 3.3 熒光定量PCR結(jié)果35-36
• 3.4 表達(dá)量統(tǒng)計學(xué)結(jié)果36-39
• 第四章 討論39-42
• 4.1 G6PD基因型c.1311C>T/IVS+1193T>C/rs1050757G是否為致病性突變的分析39-40
• 4.2 G6PD基因型c.1376G>T及c.1388G>A的表達(dá)量比較40-42
• 第五章 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 第二部分 G6PD基因與早期不明原因流產(chǎn)的關(guān)系探討46-62
• 引言46-48
• 第一章 實驗材料48-50
• 1.1 研究對象48
• 1.2 主要試劑48
• 1.3 主要實驗儀器48-50
• 第二章 實驗方法50-54
• 2.1 基因組DNA的制備50
• 2.2 基因芯片檢測及分析50-51
• 2.3 PCR擴(kuò)增51-52
• 2.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果測序52-54
• 第三章 實驗結(jié)果54-57
• 3.1 流產(chǎn)絨毛基因芯片篩查結(jié)果54
• 3.2 PCR產(chǎn)物的測序分析54-56
• 3.3 正常對照組與不明原因流產(chǎn)絨毛組測序結(jié)果比較56-57
• 第四章 討論57-59
• 第五章 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章62-63
• 英文縮略詞表63-64
• 本課題的科研資助64-65
• 致謝65

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本文編號：711521