本文關(guān)鍵詞：孤獨癥相關(guān)基因NRXN3β啟動子區(qū)域的研究

  更多相關(guān)文章： NRXN3β 啟動子 順式作用元件 轉(zhuǎn)錄因子

【摘要】：目的：確定NRXNSβ基因中具有啟動子活性功能的區(qū)域,并限定最小的啟動子區(qū)域范圍,尋找具有調(diào)控NRXN3β基因啟動子轉(zhuǎn)錄的順式作用元件所在區(qū)域,證實順式元件中對啟動子活性起主要作用的核心堿基。方法：分別構(gòu)建涵蓋Genbank數(shù)據(jù)庫里NRXN3β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游約1500bp、下游約300bp的NRXN3β基因啟動子正向序列和反向序列-熒光素酶報告基因載體。將人胚腎細(xì)胞HEK293用實驗室常規(guī)方法培養(yǎng)后,使用自Invitrogen公司購得的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000,將構(gòu)建的兩個NRXN3β基因啟動子-熒光素酶報告基因載體轉(zhuǎn)染48孔板培養(yǎng)的HEK293并使其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出熒光素酶。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行裂解,細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性使用Promega公司購得的雙熒光素酶檢測試劑(E1910)進(jìn)行測定,在同批次轉(zhuǎn)染的內(nèi)參pGL4.10載體的熒光素酶活性校準(zhǔn)后,用最終活性的比值反應(yīng)NRXN3β基因的啟動子活性,確定NRXN3β基因序列NRXN3β-1445/+302E具有啟動子活性。然后在該段序列基礎(chǔ)上進(jìn)行5’端刪切和3’端刪切并構(gòu)建相應(yīng)的啟動子-熒光素酶報告載體比較熒光素酶活性的差異,發(fā)現(xiàn)了NRXN3β基因中具有啟動子活性兩個最小區(qū)域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E,并確定對啟動子活性起調(diào)控作用的順式作用元件所存在的序列NRXN3β-110/-80o最后分別以p4NRXN3β-543/+117E, p4NRXN3β-100/+117E和p4NRXN3β-110/+117E為模版,使用基因定點突變技術(shù)在序列NRXN3P-110/-80中進(jìn)行堿基突變并比較熒光素酶活性,確定了對啟動子活性有重要作用的順式作用元件中的核心堿基。結(jié)果：成功構(gòu)建了涵蓋不同區(qū)域序列的NRXN3β基因啟動子-熒光素酶報告載體,最長插入序列片段長1747bp,包含NRXN3β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游1445bp到下游302bp的序列。繼續(xù)刪切NRXN3β-1445/+302E的5’端及3’端并轉(zhuǎn)染HEK293,發(fā)現(xiàn)序列中存在一系列影響啟動子活性的激活區(qū)域及抑制區(qū)域,同時分析發(fā)現(xiàn)序列NRXN3β-543/-121E及NRXN3β-5O/+117E這兩個序列中均可能含有啟動子最小活性區(qū)域。在啟動子NRXN3β-50/+117E的5’端刪切發(fā)現(xiàn)-110/-80區(qū)域可能包含調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄的順式作用元件,并對NRXN3β的啟動子活性可能起關(guān)鍵作用。通過對序列-110/-90的堿基進(jìn)行基因定點突變發(fā)現(xiàn),位于-107/-105、-101/-99、-98/-95的堿基是順式作用元件中的核心堿基。對比數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)-110/-80序列是一段高GC含量區(qū)域,存在多個候選轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點。結(jié)論：通過實驗我們成功找到了包含NRXN3β基因啟動子的兩個最小區(qū)域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E,并確定對啟動子活性起主要作用的序列NRXN3β-110/-80,該序列中存在調(diào)控啟動子活性的順式作用元件,確定了順式作用元件中的核心堿基所在位置。與順式作用元件互相作用的轉(zhuǎn)錄因子有待確定,同時啟動子具體結(jié)構(gòu)和功能都需要更加深入的研究來證實。
【關(guān)鍵詞】：NRXN3β 啟動子 順式作用元件 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.94
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 1 材料和方法14-25
• 1.1 材料14-15
• 1.2 方法15-25
• 2 結(jié)果25-37
• 2.1 確定構(gòu)建載體的NRXN3β基因序列具有啟動子活性25-28
• 2.2 確定序列中啟動子活性功能區(qū)的分布28-30
• 2.3 確定序列中具有啟動子活性的兩個最小區(qū)域30-32
• 2.4 證實對啟動子活性起主要作用的核心堿基32-37
• 3 討論37-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 全文總結(jié)42-43
• 文獻(xiàn)綜述43-50
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 致謝50-51
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文題目51

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本文編號：708317