本文關(guān)鍵詞：CD40siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)EAM大鼠Treg細(xì)胞的影響

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【摘要】：研究背景、目的： 病毒性心肌炎(VMC)是兒科心血管系統(tǒng)常見(jiàn)疾病,嚴(yán)重危害兒童身體健康,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,亦無(wú)特效治療。目前研究認(rèn)為,主要是病毒感染及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答導(dǎo)致的心肌損傷,其中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起主導(dǎo)作用,研究病毒性心肌炎的免疫機(jī)制已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外熱點(diǎn)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠模型因其病情進(jìn)展與人心肌炎極為相似,為研究心肌炎的免疫機(jī)制提供了最佳的動(dòng)物模型。 T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫需雙信號(hào)的活化,其中CD40與CD40配體(CD40L)是重要的共刺激信號(hào)通路之一。研究表明應(yīng)用CD40-Ig阻斷CD40/CD40L通路,能顯著減輕病毒性心肌炎小鼠心肌炎癥。能否應(yīng)用RNA干擾技術(shù)從免疫反應(yīng)的源頭即通過(guò)沉默CD40的表達(dá)來(lái)減輕心肌炎癥反應(yīng),國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先針對(duì)大鼠CD40基因構(gòu)建了CD40siRNA慢病毒載體,然后應(yīng)用 于EAM大鼠,探討CD40siRNA對(duì)心肌免疫損傷的治療作用及對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的影響。 研究方法： 1.針對(duì)大鼠CD40基因RNAi設(shè)計(jì)有效靶序列,合成靶序列的寡核苷酸序列。退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)Hpal和Xhol雙酶切后的GV118載體連接產(chǎn)生短發(fā)卡RNA慢病毒載體,PCR篩選陽(yáng)性克隆,測(cè)序鑒定。隨后進(jìn)行Wester n-blot外源篩選最佳干擾靶點(diǎn)、慢病毒包裝及病毒滴度測(cè)定。 2.40只雄性L(fǎng)ewis大鼠隨機(jī)分成4組,即正常對(duì)照組、EAM模型組、CD40siRNA治療組及siRNA對(duì)照組,每組10只大鼠。于實(shí)驗(yàn)第1天、第8天,正常對(duì)照組大鼠雙后肢足墊區(qū)皮下注射PBS緩沖液0.2ml/只；另外三組大鼠雙后足足墊區(qū)皮下注射充分混合的豬心肌球蛋白0.2ml/只。并且于實(shí)驗(yàn)第8天,CD4OsiRNA治療組尾靜脈注射25μl CD40siRNA慢病毒表達(dá)載體；siRNA對(duì)照組尾靜脈注射25μl siRNA慢病毒表達(dá)載體。于實(shí)驗(yàn)第21天處死所有大鼠,光鏡下觀察心肌病理變化并計(jì)算病理積分；流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠脾臟中CD4+CD25+Treg的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1. CD40siRNA成功插入慢病毒載體。慢病毒載體經(jīng)293T細(xì)胞包裝成功,測(cè)定病毒的滴度為2.0×109TU/mL。 2.各組大鼠均無(wú)死亡,正常對(duì)照組大鼠飲食、精神狀態(tài)良好,其他3組于實(shí)驗(yàn)第4天漸出現(xiàn)精神不振、聳毛、進(jìn)食少、懶動(dòng),部分大鼠雙足墊出現(xiàn)潰瘍、踝關(guān)節(jié)腫脹,以EAM模型組明顯。 3.EAM模型組心肌病理組織可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),伴有心肌細(xì)胞肥大變性,相鄰細(xì)胞間隙增大,核大深染；CD40siRNA治療組心肌組織病理積分明顯低于EAM模型組(2.34±0.60vs3.40±0.35,p0.05)。 4. CD40siRNA治療組大鼠脾臟CD4+CD25+Treg的表達(dá)較EAM模型組明顯上調(diào)(40.70±4.00νs12.20±1.10,p0.05)。 研究結(jié)論： 1.成功構(gòu)建大鼠CD40基因的RNAi慢病毒載體,為后期進(jìn)一步研究病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制及新的治療方法提供工作基礎(chǔ)。 2. CD40siRNA可減輕EAM大鼠的心肌炎癥,其機(jī)制可能與上調(diào)CD4+CD25+Treg的表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：CD40siRNA 自身免疫性心肌炎 大鼠 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R725.4
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 符號(hào)說(shuō)明11-12
• 前言12-13
• 第一部分 大鼠CD40基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定13-28
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-24
• 討論24-26
• 小結(jié)26-27
• 參考文獻(xiàn)27-28
• 第二部分 CD40siRNA對(duì)自身免疫性心肌炎大鼠Treg細(xì)胞的影響28-37
• 材料與方法28-31
• 結(jié)果31-33
• 討論33-35
• 小結(jié)35-36
• 參考文獻(xiàn)36-37
• 附圖37-44
• 綜述44-50
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 致謝50-51
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文51
• 大會(huì)交流51-52
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表52

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 石向華;劉小友;孫煦勇;趙明;;CD40阻斷劑對(duì)大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年12期

2 吳海;廖欽晨;賀慧娟;陳世德;伍偉鋒;黃偉強(qiáng);閉奇;;擴(kuò)張型心肌病患者CD4~+CD25~+Foxp3~+ T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[J];臨床心血管病雜志;2010年02期

3 路康;韓波;張儀;趙立健;席俊芳;張建軍;張捷;;CD_(40) Ig融合蛋白阻斷共刺激信號(hào)通路對(duì)病毒性心肌炎小鼠的治療作用[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2010年01期

4 嚴(yán)金川;楊萍;徐良潔;王標(biāo);袁偉;;SiRNA阻斷CD40-CD40L對(duì)ApoE~(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年04期

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本文編號(hào)：610127