本文關(guān)鍵詞：microRNA-106b致C2C12肌管胰島素抵抗的線(xiàn)粒體機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： miR-106b C2C12肌管 胰島素抵抗 線(xiàn)粒體功能障礙 2型糖尿病

【摘要】：肥胖和肥胖相關(guān)的2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共健康問(wèn)題。目前認(rèn)為,胰島素抵抗(insulin resistance, IR)是T2DM重要的發(fā)病機(jī)制和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在胰島素的刺激下骨骼肌是攝取葡萄糖的主要器官,占葡萄糖利用率的75%；高胰島素血癥狀態(tài)下骨骼肌糖原合成障礙是胰島素抵抗和T2DM的重要特征。因此骨骼肌胰島素抵抗在全身系統(tǒng)性胰島素抵抗中具有重要地位。但是骨骼肌胰島素抵抗的具體機(jī)制尚未闡明。microRNA (miRNA)可在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)和翻譯,miRNA表達(dá)異常是胰島素抵抗和T2DM的重要發(fā)病機(jī)制。 miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)、5'UTR和編碼區(qū)(coding sequence, CDS)互補(bǔ)配對(duì),通過(guò)抑制蛋白質(zhì)翻譯,或促進(jìn)mRNA降解途徑,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。近年來(lái)研究表明miRNA對(duì)胰島素的多種靶器官(如大腦、骨骼肌、脂肪組織、肝臟)葡萄糖的攝取均有調(diào)控作用。Saxena和Scott關(guān)于T2DM易感基因的全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)與T2DM相關(guān)的基因變異位于基因的非編碼區(qū)。這正是miRNA主要作用區(qū)域,也支持miRNA表達(dá)異常和miRNA靶基因的異常調(diào)控是胰島素抵抗和T2DM的重要發(fā)病機(jī)制的推論。 本課題組發(fā)現(xiàn)miR-106b在db/db糖尿病小鼠骨骼肌中表達(dá)顯著升高。miR-106b屬于miR-106b-25cluster成員,定位于Mcm7基因第13個(gè)內(nèi)含子上。文獻(xiàn)報(bào)道,miR-106b在糖尿病患者骨骼肌中顯著高表達(dá),后來(lái)又發(fā)現(xiàn)其在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖胰島素抵抗小鼠骨骼肌的表達(dá)量是正常飲食組的4.19倍,這與我們的結(jié)果高度一致,提示miR-106b異常高表達(dá)與骨骼肌胰島素敏感性有很大的相關(guān)性。已知線(xiàn)粒體功能障礙是肥胖相關(guān)的胰島素抵抗重要的發(fā)病機(jī)制。但是miR-106b在骨骼肌線(xiàn)粒體功能障礙和胰島素抵抗中的具體作用和機(jī)制尚未闡明。 為進(jìn)一步深度挖掘miR-106b與骨骼肌胰島素敏感性的關(guān)系,我們通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-106b與線(xiàn)粒體融合蛋白-2(mitofusin-2, Mfn2)3'U]TR有高度保守的配對(duì)結(jié)合序列。Mfn2錨定于線(xiàn)粒體外膜,除介導(dǎo)線(xiàn)粒體融合和相關(guān)功能發(fā)揮外,其還位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜成為聯(lián)系線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的橋梁。早期人們發(fā)現(xiàn)Mfn2基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有過(guò)氧化物酶體增生物激活受體-γ共激活因子-α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α)和雌激素相關(guān)受體-α(estrogen-related receptor-a, ERR-a)的順式作用元件,后兩者共同激活Mfn2的轉(zhuǎn)錄。而且Mfn2和PGC-1α在維持線(xiàn)粒體膜電位和促進(jìn)氧化磷酸化方面具有協(xié)同作用。文獻(xiàn)復(fù)習(xí)高度提示我們,Mfn2是調(diào)節(jié)骨骼肌線(xiàn)粒體功能和胰島素敏感性的重要蛋白,存在一條包含PGC-1α/Mfn2信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素敏感性。 本課題第一部分,觀察miR-106b在C2C12成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的表達(dá)及其對(duì)誘導(dǎo)分化的影響,檢測(cè)白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-αa, TNF-αa)和棕櫚酸(palmitic acid, PA)干預(yù)下miR-106b表達(dá)變化；第二部分,探討miR-106b過(guò)表達(dá)和TNF-a干預(yù)下功能沉默對(duì)C2C12肌管胰島素敏感性、線(xiàn)粒體形態(tài)和功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,驗(yàn)證靶基因Mfn2,探討miR-106b影響骨骼肌胰島素敏感性的線(xiàn)粒體機(jī)制。 第一部分：C2C12成肌細(xì)胞中miR-106b生物學(xué)功能研究 目的：①探討miR-106b在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)；②驗(yàn)證miR-106b過(guò)表達(dá)和功能沉默細(xì)胞系建立成功；③觀察miR-106b表達(dá)對(duì)C2C12成肌細(xì)胞分化的影響；④檢測(cè)TNF-α、IL-6、PA干預(yù)下C2C12肌管miR-106b表達(dá)變化。 方法：①real-time PCR檢測(cè)C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中和不同濃度的TNF-α、IL-6、PA干預(yù)24小時(shí)、48小時(shí)C2C12肌管miR-106b表達(dá)變化；②miR-106b過(guò)表達(dá)慢病毒和miR-106b inhibitor sponge慢病毒分別轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞,獲得miR-106b過(guò)表達(dá)和功能沉默細(xì)胞系,real-time PCR驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)株建立成功；③經(jīng)2%馬血清誘導(dǎo)分化,real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞分化過(guò)程中肌形成調(diào)節(jié)因子MyoD和nyogene mlRNA的表達(dá),瑞吉姆薩染色觀察肌管的形態(tài)。 結(jié)果：①C2C12誘導(dǎo)分化前、后miR-106b表達(dá)量沒(méi)有明顯的差異；②miR-106b過(guò)表達(dá)和功能沉默穩(wěn)定細(xì)胞系建立成功；③MyoD mRNA在誘導(dǎo)分化過(guò)程中表達(dá)逐漸升高,在分化第6天表達(dá)量最高,myogene mRNA在分化第3天表達(dá)量最高,分化第6天表達(dá)下降。miR-106b過(guò)表達(dá)、沉默和對(duì)照組MyoD和myogene mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。瑞吉姆薩染色顯示C2C12成肌細(xì)胞呈紡錘形或星形,單核,細(xì)胞核大而圓；分化成熟后細(xì)胞融合,體積明顯變大,長(zhǎng)條形,多核,細(xì)胞核呈串珠樣改變。miR-106b過(guò)表達(dá)、功能沉默沒(méi)有明顯改變C2C12肌管的形態(tài)。④TNF-a上調(diào)C2C12肌管miR-106b的表達(dá),具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性,20ug/ml作用48h最顯著；PA上調(diào)C2C12肌管miR-106b的表達(dá),具有濃度依賴(lài)性,200uM作用最顯著,同濃度刺激24小時(shí)和48小時(shí)沒(méi)有顯著差異：IL-6刺激前后miR-106b的表達(dá)沒(méi)有顯著差異。 結(jié)論：①miR-106b在C2C12成肌細(xì)胞分化前后表達(dá)沒(méi)有顯著差異,其對(duì)細(xì)胞分化也沒(méi)有明顯的影響；TNF-α、PA干預(yù)顯著提高C2C12肌管miR-106b的表達(dá)。 第二部分：miR-106b過(guò)表達(dá)、功能沉默對(duì)C2C12肌管胰島素敏感性的影響及線(xiàn)粒體機(jī)制分析 目的：(1)檢測(cè)miR-106b過(guò)表達(dá)對(duì)C2C12肌管胰島素敏感性、線(xiàn)粒體形態(tài)、功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,探討其影響胰島素敏感性的線(xiàn)粒體機(jī)制；(2)驗(yàn)證miR-106b與Mfn23'UTR配對(duì)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Mfn2蛋白的表達(dá)；(3)探討TNF-α干預(yù)下miR-106b功能沉默對(duì)C2C12肌管胰島素敏感性、線(xiàn)粒體形態(tài)、功能的影響和ERR-α/PGC-1α/Mfn2軸的變化,探討miR-106b參與TNF-a誘導(dǎo)胰島素抵抗的機(jī)制。 方法：(1)慢病毒介導(dǎo)miR-106b過(guò)表達(dá)：C2C12誘導(dǎo)分化后,2-Deoxy-[3H]葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C2C12肌管葡萄糖攝取率,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(glucose transporter-4,GLUT4)表達(dá)和胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)磷酸化水平,透射電鏡觀察線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu),流式細(xì)胞儀檢測(cè)C2C12肌管內(nèi)ROS含量、線(xiàn)粒體膜電位,real-time PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù),real-time PCR、Western B1ot檢測(cè)ERR-a/PGC-la mRNA和蛋白的表達(dá)；(2)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)合real-time PCR和Western Blot驗(yàn)證miR-106b對(duì)靶基因Mfn2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用；(3)慢病毒介導(dǎo)miR-106b功能沉默：C2C12成肌細(xì)胞分化第5天,TNF-a刺激48小時(shí)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2-Deoxy-[3H]葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-106b功能沉默后C2C12肌管葡萄糖攝取率,WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞膜GLUT4表達(dá),透射電鏡觀察線(xiàn)粒體超微結(jié)構(gòu),]real-time PCR檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù),real-time PCR、Western Blot檢測(cè)ERR-α/PGC-lα mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：(1)miR-106b過(guò)表達(dá)：①miR-106b過(guò)表達(dá)顯著降低C2C12肌管胰島素刺激的葡萄糖攝取,GLUT4細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,提高IRS-1-ser1101磷酸化水平；②miR-106b過(guò)表達(dá)后C2C12肌管出現(xiàn)自噬體堆積,圓球狀線(xiàn)粒體明顯增多。線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)破壞,線(xiàn)粒體雙層膜結(jié)構(gòu)消失,線(xiàn)粒體嵴模糊,甚至出現(xiàn)空泡變性。③miR-106b過(guò)表達(dá)后顯著降低線(xiàn)粒體拷貝數(shù)、膜電位,顯著增加ROS含量,降低ATP含量未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④miR-106b過(guò)表達(dá)顯著提高ERR-α/PGC-lαmRNA和蛋白的表達(dá)。 (2)靶標(biāo)驗(yàn)證：①miR-106b mimics顯著抑制雙熒光素酶活性(抑制率37%),結(jié)合位點(diǎn)1、2突變明顯提高雙熒光素酶活性,其中結(jié)合位點(diǎn)2突變效果更明顯,結(jié)合位點(diǎn)1+2突變顯著提高雙熒光素酶活性(提高20%)。②miR-106b過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組相比,Mfn2mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著差異,miR-106b過(guò)表達(dá)顯著降低Mfn2蛋白水平；miR-106b沉默顯著提高M(jìn)fn2mRNA和蛋白的表達(dá)。 (3)miR-106b功能沉默：①TNF-a20ng/ml刺激24小時(shí)顯著降低對(duì)照組胰島素刺激的葡萄糖攝取,而對(duì)miR-106b沉默組沒(méi)有顯著影響；正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高細(xì)胞膜GLUT4的表達(dá)量,TNF-α10ug/ml、20ng/ml處理后降低對(duì)照組GLUT4細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位,對(duì)miR-106b功能沉默組沒(méi)有顯著影響。②正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高M(jìn)fn2mRNA的表達(dá),TNF-α10ng/ml、20ng/ml干預(yù)后顯著降低對(duì)照組Mfn2mRNA表達(dá),對(duì)miR-106b功能沉默組沒(méi)有明顯影響。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高M(jìn)fn2蛋白的表達(dá),TNF-α20ng/ml顯著降低Mfn2蛋白的表達(dá),miR-106b功能沉默顯著改善TNF-a誘導(dǎo)的Mfn2蛋白表達(dá)下調(diào)(TNF-α10ng/ml濃度下作用最顯著)。③TNF-a導(dǎo)致線(xiàn)粒體固縮、線(xiàn)粒體雙層膜消失、線(xiàn)粒體嵴模糊,甚至空泡變性,miR-106b功能沉默顯著改善線(xiàn)粒體形態(tài)破壞。④TNF-a顯著降低C2C12肌管ATP產(chǎn)量,miR-106b功能沉默顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的ATP產(chǎn)量降低。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高C2C12肌管線(xiàn)粒體拷貝數(shù),TNF-a干預(yù)對(duì)線(xiàn)粒體拷貝數(shù)沒(méi)有顯著影響。⑤C2C12肌管對(duì)照組TNF-α20ng/ml處理后PGC-1α蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著變化,PGC-1αmRNA表達(dá)顯著降低,miR-106b功能沉默顯著增加TNF-a刺激下PGC-1α mRNA和蛋白表達(dá)。正常狀態(tài)下miR-106b功能沉默顯著提高ERR-αmRNA和蛋白的表達(dá),TNF-α干預(yù)顯著降低對(duì)照組ERR-a蛋白表達(dá),提向ERR-αmlRNA的表達(dá),TNF-α對(duì)miR-106b功能沉默組ERR-αmRNA和蛋白的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。 結(jié)論：miR-106b過(guò)表達(dá)可能主要通過(guò)下調(diào)靶基因Mfn2介導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙,從而誘導(dǎo)C2C12肌管胰島素抵抗。miR-106b功能沉默可能通過(guò)上調(diào)靶基因Mfn2參與調(diào)控TNF-a誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能功能障礙和胰島素抵抗。
【關(guān)鍵詞】：miR-106b C2C12肌管 胰島素抵抗 線(xiàn)粒體功能障礙 2型糖尿病
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R723.14;R725.8
【目錄】：

• 縮略詞一覽表6-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-19
• 前言19-23
• 第一部分 C2C12成肌細(xì)胞中microRNA-106b生物學(xué)功能研究23-34
• 引言23-24
• 材料與方法24-29
• 結(jié)果29-33
• 討論33-34
• 第二部分 microRNA-106b過(guò)表達(dá)、功能沉默對(duì)C2C12肌管胰島素敏感性的影響及線(xiàn)粒體機(jī)制分析34-58
• 引言34-35
• 材料與方法35-44
• 結(jié)果44-54
• 討論54-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 綜述64-82
• 參考文獻(xiàn)75-82
• 附錄82-87
• 致謝87-88

【參考文獻(xiàn)】

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1 張瑩;高春林;夏正坤;高遠(yuǎn)賦;樊忠民;蔡曉懿;劉夢(mèng)原;;MiR-106b在2型糖尿病db/db小鼠骨骼肌中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2013年03期

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本文編號(hào)：604849