本文關(guān)鍵詞：硫化氫對(duì)人絨毛膜前列腺素代謝酶的調(diào)節(jié)及其機(jī)制

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【摘要】：早產(chǎn)在我國(guó)的發(fā)病率約為8.1%,其近遠(yuǎn)期并發(fā)癥較多,給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力,但由于人類(lèi)分娩發(fā)動(dòng)的確切機(jī)制尚未完全闡明,臨床上仍缺乏預(yù)測(cè)和治療早產(chǎn)的有效措施。分娩是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜的生理變化過(guò)程,妊娠期間大部分時(shí)間子宮均處于靜息狀態(tài),而至妊娠末期,子宮開(kāi)始出現(xiàn)規(guī)律宮縮,并逐漸加強(qiáng),最終促使胎兒娩出體外。且在該過(guò)程中,羊膜、絨毛膜、胎盤(pán)等宮內(nèi)組織來(lái)源的前列腺素(prostaglandin, PG)發(fā)揮重要作用。目前的研究顯示：絨毛膜可高表達(dá)前列腺素代謝酶-NAD依賴(lài)的15-羥基前列腺素脫氫酶(15-hydroxyprosglandin dehydrogenase, PGDH),由于其處于羊膜和子宮肌之間,妊娠期絨毛膜高表達(dá)的PGDH構(gòu)成一道前列腺素代謝屏障,調(diào)控胎膜PG到達(dá)子宮肌的量。本實(shí)驗(yàn)室前期研究提示分娩啟動(dòng)和H2S有相關(guān)性,但進(jìn)一步的研究尚未進(jìn)行。因此本課題首先以原代培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞為研究對(duì)象,首先確定原代培養(yǎng)的細(xì)胞中有CBS和CSE的表達(dá),且有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力。然后明確H2S對(duì)PGDH表達(dá)和生物活性的調(diào)節(jié)作用,利用RNA干擾技術(shù),進(jìn)一步明確在人絨毛膜細(xì)胞中內(nèi)源性H2S生成的關(guān)鍵酶。很多的研究發(fā)現(xiàn)：microRNA幾乎參與了生物的所有病理生理過(guò)程,如發(fā)育、增殖、凋亡、癌變等,且2009年已經(jīng)有研究報(bào)道,多種microRNA在分娩前后、早產(chǎn)臨產(chǎn)前后有差異表達(dá),這就提示我們microRNA參與了分娩啟動(dòng)這一生理過(guò)程,且在心血管系統(tǒng),已經(jīng)有研究顯示,H2S可上調(diào)miR-133a的表達(dá)。為此,本課題進(jìn)一步探討了H2S調(diào)控PGDH的microRNA機(jī)制。接下來(lái),本課題首先構(gòu)建了含有PGDH3'UTR雙熒光報(bào)告基金的質(zhì)粒及針對(duì)microRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變的突變體質(zhì)粒,利用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)明確不同rnicroRNA對(duì)PGDH3'UTR是否有直接靶作用,并利用Western blot方法探討H2S是否可通過(guò)對(duì)以上rnicroRNA的影響實(shí)現(xiàn)對(duì)PGDH的調(diào)節(jié),并最終參與到對(duì)局部前列腺素濃度的調(diào)節(jié)中。最后我們?cè)诮M織水平檢測(cè)不同妊娠狀態(tài)下,CBS、PGDH和不同microRNAs的表達(dá)變化情況,從細(xì)胞和組織兩水平說(shuō)明microRNA可參與妊娠維持和分娩啟動(dòng)過(guò)程中。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、H2S對(duì)原代培養(yǎng)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中PGDH表達(dá)和生物活性的影響 為說(shuō)明原代培養(yǎng)的絨毛膜細(xì)胞有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力,我們?cè)囵B(yǎng)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞,利用PCR和Western blot方法顯示細(xì)胞中有H2S合成酶CBS、CSE的表達(dá),利用極譜法證明細(xì)胞有產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的能力；real time PCR方法顯示細(xì)胞內(nèi)CBS的量顯著多于CSE;real-time PCR和Western blot及ELISA方法的結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中H2S可時(shí)間和劑量依賴(lài)性的促進(jìn)PGDH表達(dá)和生物活性,采用CBS的阻斷劑AOAA以及siRNA特異性敲低內(nèi)源性CBS表達(dá)后,L-半胱氨酸上述的促進(jìn)作用被阻斷。以上結(jié)果證明：內(nèi)源性H2S主要在CBS的作用下產(chǎn)生,并發(fā)揮對(duì)PGDH表達(dá)和生物活性的上調(diào)作用。 2、H2S調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中PGDH表達(dá)和活性的可能機(jī)制 在原代培養(yǎng)的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中,為明確miR-26a/b和miR-199a是否為PGDH的靶基因,首先,利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將miR-26a、miR-26b和miR-199a的類(lèi)似物(inhibitors)和抑制物(mimics)轉(zhuǎn)入細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：抑制miR-26b、miR-199a的表達(dá)后,PGDH的蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)它們的表達(dá)后,PGDH的蛋白表達(dá)減少；而miR-26a的inhibitor和mimic對(duì)PGDH的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響,提示PGDH可能是miR-26b和miR-199a的靶基因,而PGDH可能不是miR-26a的靶基因；接下來(lái),構(gòu)建含有miR-26a/b、miR-199a結(jié)合位點(diǎn)的PGDH3'UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及其針對(duì)上述microRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變的突變體質(zhì)粒,將其和上述microRNA的類(lèi)似物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-26b和miR-199a均可降低PGDH3'UTR的熒光素酶活性,而針對(duì)它們的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變后,上述抑制作用消失,這就證明了PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因。而miR-26a對(duì)PGDH3'UTR的熒光素酶活性沒(méi)有影響,證明了PGDH不是miR-26a的靶基因。為進(jìn)一步說(shuō)明H2S是否可通過(guò)miR-26b和miR-199a實(shí)現(xiàn)對(duì)PGDH的上調(diào)作用,本課題首先驗(yàn)證了H2S可抑制miR-26b和miR-199a的表達(dá);然后給予miR-26b和miR-199a的類(lèi)似物預(yù)處理細(xì)胞后,再給予NaHS和L-半胱氨酸處理細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),H2S對(duì)PGDH的上調(diào)作用消失了,綜合以上結(jié)果得出：PGDH是miR-26b、miR-199a的靶基因；H2S能通過(guò)抑制miR-26b、 miR-199a的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)PGDH的上調(diào)作用,雖然miR-26a不是PGDH的靶基因,但其表達(dá)仍受到H2S的調(diào)節(jié)。 3、足月臨產(chǎn)、足月未臨產(chǎn)、自發(fā)性早產(chǎn)絨毛膜組織中CBS、PGDH和miR-26a、miR-26b、miR-199a的表達(dá) 為在組織水平驗(yàn)證足月臨產(chǎn)和早產(chǎn)臨產(chǎn)前后CBS、PGDH和上述microRNA是否發(fā)生改變,本課題組收集足月臨產(chǎn)、足月未臨產(chǎn)、自發(fā)性早產(chǎn)絨毛膜組織各10例,利用RT-PCR方法檢測(cè),結(jié)果顯示,與足月未臨產(chǎn)組相比,足月臨產(chǎn)組的絨毛膜組織中,CBS和PGDH的表達(dá)顯著減少,miR-26b和miR-199a的表達(dá)均顯著增加,與足月臨產(chǎn)組相比,CBS和PGDH的表達(dá)進(jìn)一步減少,miR-26b和miR-199a的表達(dá)均增加更顯著；而miR-26a表現(xiàn)出與此相反的趨勢(shì)。結(jié)果與細(xì)胞結(jié)果一致。 結(jié)論： CBS在內(nèi)源性H2S的生成過(guò)程中發(fā)揮主要的作用；PGDH是miR-26b和miR-199a的靶基因；H2S通過(guò)減少miR-26b和miR-199a的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)PGDH的上調(diào)作用,從而減少到達(dá)宮體的前列腺素濃度,進(jìn)而參與到妊娠維持和分娩啟動(dòng)的過(guò)程中。
【關(guān)鍵詞】：絨毛膜 硫化氫 15-羥基前列腺素脫氫酶 microRNA
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R722.6
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮寫(xiě)詞匯11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-52
• 討論52-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 綜述61-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況68-69
• 致謝69-70

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：591105