本文關(guān)鍵詞：microRNA-30e在膿毒癥急性肺損傷中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景：膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),是各種微生物及免疫原性物質(zhì)引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)和宿主自身的一種免疫性損傷,臨床上病情進(jìn)一步發(fā)展可引起嚴(yán)重膿毒癥、膿毒癥休克和多器官障礙綜合征,發(fā)病率和死亡率高,是PICU患兒死亡的主要原因之一。嚴(yán)重膿毒癥發(fā)生時,可出現(xiàn)多個器官的功能損傷,形成多器官功能障礙(MODS),其中肺臟的損傷首當(dāng)其沖,最終可發(fā)展成為急性肺損傷(ALi)甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS) 。 ALI/ARDS病變以彌漫性肺細(xì)胞損傷為主,病理特征包括肺血管損傷所致的肺水腫和肺組織炎性細(xì)胞浸潤,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的低氧血癥、彌漫性肺浸潤和肺水腫。膿毒癥-急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征目前死亡率已達(dá)25%-40%,成為重癥監(jiān)護(hù)室病人死亡的首要原因,因此,探索膿毒癥-急性肺損傷的生物學(xué)標(biāo)志,對疾病的早期診斷、治療效果判斷、預(yù)后評估具有非常重要的現(xiàn)實意義。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的可通過特異性識別靶基因mRNA的3;端非編碼區(qū)位點(diǎn)來抑制蛋白翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解,從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一類非編碼小分子RNA,在細(xì)胞增殖和調(diào)亡,組織分化,組織炎癥反應(yīng)和腫瘤形成等多個生理和病理過程起著重要調(diào)控作用,其中在機(jī)體膿毒癥炎癥反應(yīng)中起調(diào)控作用的miRNA近年來研究較多也較熱門。而有關(guān)miRNA在膿毒癥炎癥反應(yīng)中所發(fā)揮作用的相關(guān)研究則越來越多的受到重視,如：miR-147, miR-98, let-7,miR-346, miR-9, miR-155等均已被證實在膿毒癥中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA-30e (microRNA-30e-5p)是miR-30家族的成員之一,參與多個細(xì)胞進(jìn)程,如：肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡,促使乳腺癌細(xì)胞的調(diào)亡和抑制再生,腫瘤細(xì)胞自噬,脂肪細(xì)胞分化,細(xì)胞衰老,上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),減輕缺血性心肌損傷等。在免疫炎癥和膿毒癥方面的研究報道雖少,其作用卻不可忽視。研究發(fā)現(xiàn)用LPS刺激人足細(xì)胞可顯著下調(diào)miR-30家族。另外有報道m(xù)iR-30家族的眾多靶蛋白中,Notchl可增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)激活的NF-K B信號通路活性,進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。預(yù)先通過藥物抑制或基因沉默的方式阻斷Notchl的活化,可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥的上調(diào)趨勢。研究目的：1.探討膿毒癥大鼠受損肺組織及脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞不同時間點(diǎn)miR-30e的表達(dá)及其與炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性；2.探討被上調(diào)或下調(diào)的miR-30e對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮的作用；3.初步探討上調(diào)或下調(diào)的miR-30e對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用的機(jī)制。研究方法：1.建膿毒癥大鼠模型,觀察大鼠一般情況,采集肺組織標(biāo)本,分析肺組織病理結(jié)構(gòu)的變化,判斷模型是否構(gòu)建成功。用RT-qPCR方法檢測膿毒癥大鼠肺組織中miR-30e和炎癥指標(biāo)的表達(dá)情況,并分析兩者的相關(guān)性；2.構(gòu)建NR8383細(xì)胞(肺泡巨噬細(xì)胞)的膿毒癥模型,在LPS刺激的NR8383細(xì)胞Oh、3h、6h、12h、24h五個時間點(diǎn)檢測miR-30e和炎癥因子表達(dá)水平的變化,并分析兩者的相關(guān)性；3.采用microRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫對rno-miRNA-30e-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測,以兩個或以上軟件共同預(yù)測結(jié)果作為其候選靶基因。對miR-30e及靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測其結(jié)合位點(diǎn)及相關(guān)信號通路,在LPS處理的肺泡巨噬細(xì)胞中用Western Blot方法檢測靶蛋白的表達(dá)；4.將niR-30e mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染至NR8383細(xì)胞,用RT-qPCR方法檢測炎癥因子的mRNA水平的表達(dá)改變,ELISA法檢測炎癥因子的蛋白水平表達(dá)改變,并用Western Blot檢測靶蛋白的表達(dá)；5.統(tǒng)計方法：用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,多組樣本均數(shù)比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P0.05,為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性檢驗,當(dāng)雙變量都服從正態(tài)分布時采用Pearson相關(guān)分析,不服從時則采用Spearman相關(guān)分析。以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果：1.大鼠膿毒癥模型的建立及肺組織的病理改變。正常對照組大鼠一般情況良好,活動自如,呼吸平穩(wěn),飲食飲水未見異常,對外界刺激的反應(yīng)正常。LPS處理組大鼠在LPS注射后30分鐘開始出現(xiàn)躁動不安,心率、呼吸頻率顯著加快；LPS注射后3小時,呼吸急促癥狀明顯,四肢、唇鼻紫紺,體溫上升,并出現(xiàn)精神反應(yīng)差、蜷縮懶動、肌張力下降、不思飲食、嗜睡、豎毛、腹瀉、對外界刺激反應(yīng)減弱等內(nèi)毒素血癥表現(xiàn),部分大鼠口鼻有紅色泡沫樣液體溢出。肺組織石蠟切片HE染色顯示：各膿毒癥組大鼠肺組織可見結(jié)構(gòu)破壞,肺泡膨脹不全、肺泡融合或塌陷,肺泡腔內(nèi)有滲出液；肺泡間隔明顯增厚,可見大量炎性細(xì)胞浸潤；肺組織毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血,管腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞,甚至有血栓形成,隨著膿毒癥炎癥損傷時間的延長,肺組織損傷程度不斷加重。2.膿毒癥大鼠肺組織miR-30e、炎癥因子改變,及兩者之間的相關(guān)性。各膿毒癥組大鼠肺組織miR-30e表達(dá)水平相比正常對照組均明顯下調(diào),且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),其中模型組24h下調(diào)最明顯；膿毒癥組3h、6h、12h、 24hIL-1β、TNF-α相對表達(dá)水平與正常對照組相比均顯著上升(P0.01),且在膿毒癥3h時達(dá)到最高峰,隨后開始下降,但與正常對照組相比仍然明顯上調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義。各實驗組大鼠肺組織中miR-30e與IL-1β水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.417,P=0.022),與TNF-α水平也呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.437,P=0.016)。3.LPS刺激NR8383細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞中miR-30e、炎癥因子的表達(dá)改變,及兩者之間的相關(guān)性。LPS刺激3、6、12、24小時后miR-30e表達(dá)水平相比空白對照組均明顯下調(diào),且具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。其中LPS3h組下調(diào)最明顯；LPS刺激3、6、12、24小時后IL-1β、TNF-α相對表達(dá)水平相比空白對照組均顯著上升(P0.01),且同膿毒癥大鼠肺組織結(jié)果一致,在LPS3h組時達(dá)到最高峰,隨后開始下降,但與空白對照組相比仍然明顯上調(diào)且有統(tǒng)計學(xué)意義。LPS刺激NR8383細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞中miR-30e的表達(dá)水平與IL-1β水平呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.713,P=0.003),與TNF-α水平也呈明顯負(fù)相關(guān)性(r=-0.712,P=0.002)。4.miR-30e靶基因的預(yù)測及驗證。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示,miR-30e 5'端種子區(qū)與Notch1 mRNA 3'UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合,提示Notch1基因很可能是miR-30e作用的靶基因,為后續(xù)的實驗提供了理論基礎(chǔ)。LPS刺激NR8383細(xì)胞6、12、24小時后細(xì)胞中Notch1蛋白含量灰度值均較LPS0h、LPS3h組明顯上調(diào),隨著刺激時間的延長,Notch1蛋白表達(dá)逐漸增加,且均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組Notch1蛋白的表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f=33.767,P0.01)；LPS+ miR-30e i組較LPS+NC i組Notch1蛋白的表達(dá)水平明顯升高,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-11.371,P0.01),表明Notch1蛋白表達(dá)受到miR-30e的調(diào)控。5.miR-30e對LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞NR8383炎癥反應(yīng)發(fā)揮的作用。LPS+miR-30e m組較LPS+NC m組TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯降低(TNF-α:t=19.574,P0.01;IL-1β:f=3.477,P=0.025)；與LPS+NC i組相比較,LPS+miR-30e i組1NF-α.IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯升高(TNF-α: t=-6.606,P0.01;IL-1p:f=-3.457,P=0.026).LPS+miR-30e m組較LPS+ NC m組的TNF-α/IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯降低(TNF-α:t=5.899,P=0.004； IL-1β:t=5.107,P=0.007)；而與LPS+NC i組相比較,LPS+miR-30e i組TNF-α、 IL-1β的蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(1NF-α:t=-6.785,尸 =0.002；IL-1β:t=-3.662,P=0.022).研究結(jié)論：1.本研究通過體內(nèi)和體外兩個層面發(fā)現(xiàn)：miR-30e在膿毒癥誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)生時的表達(dá)量顯著下調(diào),并與炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)；2. miR-30e很可能部分通過Notch1負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),而Notch1信號通路在其中的具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA-30e 膿毒癥急性肺損傷 Notch1 NR8383 炎癥因子
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R720.597
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-18
• 第一章 microRNA-30e在膿毒癥急性肺損傷中的表達(dá)及與炎癥因子水平的相關(guān)性18-38
• 引言18-19
• 第一節(jié) 材料與方法19-30
• 第二節(jié) 結(jié)果30-34
• 第三節(jié) 討論34-38
• 第二章 mircoRNA-30e靶向Notch1負(fù)性調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)38-57
• 引言38-39
• 第一節(jié) 材料與方法39-46
• 第二節(jié) 結(jié)果46-53
• 第三節(jié) 討論53-57
• 參考文獻(xiàn)57-64
• 攻讀碩士期間研究成果64-65
• 致謝65-66

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本文編號：565503