本文關(guān)鍵詞：小鼠IL-17A和IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定

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【摘要】：第一部分小鼠IL-17A基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定 目的：構(gòu)建小鼠IL-17A基因真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)IL-17A的能力。 方法：根據(jù)Genbank中小鼠IL-17AmRNA序列（NM_010552.3）設(shè)計(jì)PCR引物，兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，，提取小鼠脾臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以此為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，將目的基因亞克隆至T載體中，重組T載體經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定正確后，雙酶切重組T載體，回收目的片段，在T4連接酶作用下定向克隆至真核質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中，構(gòu)建IL-17A基因真核表達(dá)載體LVX-IL-17A-IRES-ZsGreen1，進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA的表達(dá)量，用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。 結(jié)果：重組T載體及真核表達(dá)載體雙酶切后電泳可見(jiàn)約500bp片段，與目的基因大小相符，測(cè)序結(jié)果與IL-17A基因進(jìn)行BLAST比對(duì)分析完全吻合。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA表達(dá)水平均明顯增高（P均0.05）,細(xì)胞上清中IL-17A表達(dá)水平均明顯增高(P均0.05)。 結(jié)論：本研究從小鼠脾臟組織中成功克隆了IL-17A基因，構(gòu)建了高表達(dá)小鼠IL-17A的真核表達(dá)質(zhì)粒，為今后研究IL-17A在腎小球疾病中的作用及分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 第二部分小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制IL-17A表達(dá)的有效序列篩選 目的：構(gòu)建3個(gè)小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒，在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其抑制IL-17A表達(dá)的能力并篩選出抑制效率最佳的序列。 方法：根據(jù)GenBank中小鼠IL-17AmRNA序列（NM_010552.3），利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條shRNA序列及1條陰性對(duì)照序列，兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，合成Oligo DNA，退火形成雙鏈后，在T4DNA連接酶作用下定向克隆至真核載體pLVX-shRNA中，獲得3個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒（shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAC），并進(jìn)行測(cè)序鑒定。293T細(xì)胞分為空白對(duì)照組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNAC組，各組分別進(jìn)行各干擾質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA的表量達(dá)，用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。 結(jié)果：各shRNA表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Oligo DNA完全一致；與shRNA C組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3組轉(zhuǎn)染后24h、48h細(xì)胞IL-17A基因mRNA水平顯著降低（P均0.05），shRNA1表達(dá)水平最低；細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平一致。 結(jié)論：成功構(gòu)建3個(gè)小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒；3個(gè)IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)IL-17A的表達(dá)均有抑制作用，以shRNA1抑制效果最佳。
【關(guān)鍵詞】：IL-17A基因 真核表達(dá)質(zhì)粒 293T細(xì)胞 IL-17A基因 RNAi shRNA 表達(dá)質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R726.9;R3416
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 第一部分 小鼠 IL-17A 基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定15-40
• 前言15-17
• 1 材料與方法17-31
• 2 結(jié)果31-36
• 3 討論36-37
• 4 小結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 第二部分 小鼠 IL-17AshRNA 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制 IL-17A 表達(dá)的有效序列篩選40-51
• 前言40-41
• 1 材料與方法41-45
• 2 結(jié)果45-47
• 3 討論47-48
• 4 小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 全文總結(jié)51-52
• 附圖52-54
• 文獻(xiàn)綜述54-64
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 致謝64-65
• 攻讀學(xué)位期間研究成果及發(fā)表文章目錄65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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本文編號(hào)：540183