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小鼠IL-17A和IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定

發(fā)布時(shí)間:2017-07-14 07:21

  本文關(guān)鍵詞:小鼠IL-17A和IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定


  更多相關(guān)文章: IL-17A基因 真核表達(dá)質(zhì)粒 293T細(xì)胞 IL-17A基因 RNAi shRNA 表達(dá)質(zhì)粒


【摘要】:第一部分小鼠IL-17A基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定 目的:構(gòu)建小鼠IL-17A基因真核表達(dá)載體,在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)IL-17A的能力。 方法:根據(jù)Genbank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM_010552.3)設(shè)計(jì)PCR引物,兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),,提取小鼠脾臟組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,以此為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增,將目的基因亞克隆至T載體中,重組T載體經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定正確后,雙酶切重組T載體,回收目的片段,在T4連接酶作用下定向克隆至真核質(zhì)粒載體pLVX-IRES-ZsGreen1中,構(gòu)建IL-17A基因真核表達(dá)載體LVX-IL-17A-IRES-ZsGreen1,進(jìn)行雙酶切及測(cè)序鑒定。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA的表達(dá)量,用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。 結(jié)果:重組T載體及真核表達(dá)載體雙酶切后電泳可見(jiàn)約500bp片段,與目的基因大小相符,測(cè)序結(jié)果與IL-17A基因進(jìn)行BLAST比對(duì)分析完全吻合。與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA表達(dá)水平均明顯增高(P均0.05),細(xì)胞上清中IL-17A表達(dá)水平均明顯增高(P均0.05)。 結(jié)論:本研究從小鼠脾臟組織中成功克隆了IL-17A基因,構(gòu)建了高表達(dá)小鼠IL-17A的真核表達(dá)質(zhì)粒,為今后研究IL-17A在腎小球疾病中的作用及分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。 第二部分小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制IL-17A表達(dá)的有效序列篩選 目的:構(gòu)建3個(gè)小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒,在293T細(xì)胞中驗(yàn)證其抑制IL-17A表達(dá)的能力并篩選出抑制效率最佳的序列。 方法:根據(jù)GenBank中小鼠IL-17AmRNA序列(NM_010552.3),利用Invitrogen公司網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)3條shRNA序列及1條陰性對(duì)照序列,兩端分別引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),合成Oligo DNA,退火形成雙鏈后,在T4DNA連接酶作用下定向克隆至真核載體pLVX-shRNA中,獲得3個(gè)shRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAC),并進(jìn)行測(cè)序鑒定。293T細(xì)胞分為空白對(duì)照組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNAC組,各組分別進(jìn)行各干擾質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,用Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞IL-17AmRNA的表量達(dá),用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)量。 結(jié)果:各shRNA表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Oligo DNA完全一致;與shRNA C組相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3組轉(zhuǎn)染后24h、48h細(xì)胞IL-17A基因mRNA水平顯著降低(P均0.05),shRNA1表達(dá)水平最低;細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A表達(dá)水平與mRNA表達(dá)水平一致。 結(jié)論:成功構(gòu)建3個(gè)小鼠IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒;3個(gè)IL-17AshRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)IL-17A的表達(dá)均有抑制作用,以shRNA1抑制效果最佳。
【關(guān)鍵詞】:IL-17A基因 真核表達(dá)質(zhì)粒 293T細(xì)胞 IL-17A基因 RNAi shRNA 表達(dá)質(zhì)粒
【學(xué)位授予單位】:重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2013
【分類(lèi)號(hào)】:R726.9;R3416
【目錄】:
  • 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
  • 中文摘要7-11
  • 英文摘要11-15
  • 第一部分 小鼠 IL-17A 基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定15-40
  • 前言15-17
  • 1 材料與方法17-31
  • 2 結(jié)果31-36
  • 3 討論36-37
  • 4 小結(jié)37-38
  • 參考文獻(xiàn)38-40
  • 第二部分 小鼠 IL-17AshRNA 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及抑制 IL-17A 表達(dá)的有效序列篩選40-51
  • 前言40-41
  • 1 材料與方法41-45
  • 2 結(jié)果45-47
  • 3 討論47-48
  • 4 小結(jié)48-49
  • 參考文獻(xiàn)49-51
  • 全文總結(jié)51-52
  • 附圖52-54
  • 文獻(xiàn)綜述54-64
  • 參考文獻(xiàn)59-64
  • 致謝64-65
  • 攻讀學(xué)位期間研究成果及發(fā)表文章目錄65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 司中洲;李亭;李杰群;齊海智;謝續(xù)標(biāo);;白細(xì)胞介素-17與Th17細(xì)胞在小鼠腎移植急性排斥反應(yīng)中的表達(dá)及意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年08期

2 董光富,葉任高,史偉,董秀清,陽(yáng)曉,余學(xué)清,楊念生;狼瘡樣腎炎鼠白細(xì)胞介素-17的表達(dá)及其作用研究初探[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2002年02期

3 連海峰;吳小翎;;神經(jīng)纖毛蛋白1基因RNA干擾質(zhì)粒對(duì)胃腺癌細(xì)胞SGC7901增殖和凋亡的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2010年11期

4 崔潔;蔣明德;梅浙川;陳麗;曾維政;鄭淑梅;王釗;;人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2013年01期

5 王莉;李秋;王莉佳;李欣;;原發(fā)性腎病綜合征患兒外周血Th17與CD4~+ CD25~+ Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年08期



本文編號(hào):540183

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