本文關(guān)鍵詞：基于中醫(yī)異病同證理論探討輪狀病毒與HBGA相關(guān)性的初步研究

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【摘要】：病毒性胃腸炎又稱病毒性腹瀉,是一組由多種病毒引起的急性腸道傳染病。目前研究表明輪狀病毒(Rotavirus, RV)、諾如病毒(Norovirus, NoV)是急性病毒性胃腸炎的最主要的兩種病原體,占到所有病原體的60%以上。盡管各種病原體的基因組結(jié)構(gòu)不盡相同,但它們所致胃腸炎的臨床表現(xiàn)基本類似,主要表現(xiàn)為：起病急、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉,排水樣便或稀便,也可有發(fā)熱及全身不適等癥狀。因?yàn)镽V和NoV是兩種不同的病原體,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常將RV和NoV胃腸炎分屬為兩種不同的疾病進(jìn)行論述。由于兩者都具有嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等相同的臨床癥狀和體征,RV和NoV胃腸炎應(yīng)同屬中醫(yī)“泄瀉”范疇,其病因病機(jī)之關(guān)鍵在于脾虛濕盛。證,是機(jī)體在疾病發(fā)展過程中的某一階段的病理概括,亦機(jī)體對病因作用的整體反應(yīng)狀態(tài),反應(yīng)了疾病發(fā)展過程中某一階段病理變化的本質(zhì)。既然RV和NoV胃腸炎具有相同(或相似)的證,那么,RV與NoV感染是否存在著“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)呢?從組成人體的物質(zhì)分子方面分析引起證的物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí),中醫(yī)證的本質(zhì)是一類具有信使分子性能的蛋白質(zhì)和肽類分子。從病毒感染人體的發(fā)病機(jī)制而言,細(xì)胞表面的特異性受體是病毒感染宿主細(xì)胞的決定因素之一�；诖�,本課題提出：RV和NoV胃腸炎“異病同證”的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與相似的受體或共受體有關(guān),即兩種病毒存在相同的受體或共受體。由于NoV不能體外培養(yǎng),亦無小動(dòng)物模型,經(jīng)過近十余年來的志愿者攻擊試驗(yàn)、分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,現(xiàn)已基本確認(rèn)腸道黏膜上的人類組織血型抗原(human histo-blood group antigens, HBGA)是NoV的病毒受體。HBGA是紅細(xì)胞、呼吸道、泌尿生殖道和消化道粘膜上皮細(xì)胞表面的一類復(fù)雜的碳水化合物(以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在),也可以自由寡聚糖的形式分泌在唾液、血液、母乳和腸道等體液中。在腸道上皮細(xì)胞上表現(xiàn)為ABH和Lewis抗原,對應(yīng)在紅細(xì)胞上表現(xiàn)為分泌型(A、B、O血型)和非分泌型。HBGA受體的發(fā)現(xiàn)成為NoV研究的里程碑,極大地推進(jìn)了NoV與人類宿主相互作用關(guān)系、病毒進(jìn)化及免疫學(xué)機(jī)制等方面的研究。目前,RV的受體研究主要集中在細(xì)胞功能性蛋白上,初步認(rèn)為Toll樣受體、整合素家族、神經(jīng)節(jié)苷脂、熱應(yīng)激同源蛋白(Hsc70)等都有一定的作用。近期有研究表明,RV感染與HBGA受體存在相關(guān)性。本課題組在RV感染可能與HBGA相關(guān)的研究基礎(chǔ)上,提出“RV和NoV胃腸炎異病同證的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與相似的受體或共受體有關(guān)”。首先,我們運(yùn)用分子流行病學(xué)方法,收集臨床腹瀉患者的糞便標(biāo)本和配對唾液,以RV陰性和健康人群為對照,分析比較RV感染和HBGA相關(guān)性。同時(shí),運(yùn)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法表達(dá)RV的衣殼蛋白VP8*,進(jìn)行體外RV-VP8*與唾液HBGA的結(jié)合方式研究。(一)輪狀病毒感染與HGBA相關(guān)性的流行病學(xué)研究2013-2014年間在南方醫(yī)院兒科門診收集病毒性腹瀉患者糞便及配對唾液樣本,并以廣州某小學(xué)的健康人群唾液作為對照。糞便樣本通過trizol法行RNA提取,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板,行PCR擴(kuò)增RV-VP4區(qū)域以及NoVG I型GII型片段。RV陽性樣本進(jìn)一步用分型引物進(jìn)行分型,不能用分型引物分型者經(jīng)公司測序后結(jié)合NCBI BLAST功能以確定其基因型別。配對唾液的HBGA表型鑒定用ELISA方法,檢測的單抗包括A、B、H、Lewis a、Lewis b、Lewis x, Lewis y。其中,Lea-b+和/或Lex-y+為分泌型,Lea+b+和／或Le x+y+為部分分泌型,二者均歸入分泌型；Lea+b-和／或Lex+y-為非分泌型。南方醫(yī)院配對樣本共266份,RV陽性樣本75份,配對唾液樣本中,檢出A型22份,B型17份,O型33份,AB型3份;Lea-b+/Lex-y+63份,Lea+b+/Lex+y+12份,Lea+b-/Lex+y-0份,分泌型75份,非分泌型0份。陰性樣本191份,剔除NoV陽性樣本40例后總樣本151份, 檢出A型47份,B型44份,O型50份,AB型10份；Lewis狀態(tài)結(jié)果Lea-b+/Lex-y+132份,Lea+b+/Lex+y+9份,Lea+b-/Lex+y-10份;分泌型141份,非分泌型10份。用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,統(tǒng)計(jì)方法用χ2檢驗(yàn),RV陽性與陰性之間的血型差異Pearson χ2=3.047,自由度=3,P值=0.384(P0.05),即RV陰陽性之間的血型差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lewis狀態(tài)用Fisher精確檢驗(yàn),χ2=10.659,自由度=2,P值=0.004(P0.05),Lewis狀態(tài)在RV感染與否中有顯著性差異,即Lewis狀態(tài)對RV感染與否有影響。分泌型在RV感染與否中,P值=0.033(P0.05),數(shù)據(jù)顯示分泌型在腹瀉患者中對RV感染與否有顯著性差異,RV感染與HBGA分泌型有關(guān)。通過對健康人群159份唾液進(jìn)行HBGA表型分析,結(jié)果表明,A型為35份,B型39份,O型79份,AB型6份；Lea+b+/Lex+y+134份,Lea+b-/Lex+y-5份,Lea+b-/Lex+y-20份：即分泌型139份(87.4%),非分泌型20份(12.6%)。RV陽性樣本HBGA狀態(tài)如前所述。用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對RV陽性和健康對照進(jìn)行兩組間的x2檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間的ABO血型差異Pearson卡方=1.546,P值=0.672(P0.05),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組間的Lewis狀態(tài)經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn),P值=0.000(P0.05),存在顯著性差異。分泌型狀態(tài)經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn),P=0.001(P0.05),亦存在顯著性差異。結(jié)果充分表明：RV感染雖然與患者的ABO血型狀態(tài)沒有明顯相關(guān),但是與患者的分泌型狀態(tài)存在明顯的相關(guān)性,RV只感染分泌型患者,而不感染非分泌型患者。(二)輪狀病毒VP8*與唾液HBGA的結(jié)合方式研究隨機(jī)選取選取3份輪狀病毒P[8]和3份P[4]陽性樣本,經(jīng)one-step RT-PCR試劑盒擴(kuò)增VP4區(qū)域后,再行高保真酶擴(kuò)增VP8*,將目的基因VP8*插入Pjet-2載體后,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入top10后行質(zhì)粒提取。重組質(zhì)粒與pGEX-4T-1載體經(jīng)BamH I、Sai Ⅰ雙酶切后切膠回收純化,線性載體pGEX-4T-1與目的片段VP8*連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞top10,經(jīng)菌落PCR或者菌落搖菌后質(zhì)粒提取行BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定。對正確插入目的片段的質(zhì)粒pGEX-4T-1-VP8*再次轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21,通過挑選菌落搖菌、擴(kuò)大培養(yǎng)、離心、重懸、超聲破菌、離心以及與GST親和柱吸附等步驟進(jìn)行蛋白表達(dá)。最后成功表達(dá)P[8](GZ023株)和P[4](GZ705)株樣本GST-VP8*蛋白。經(jīng)對洗脫蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析,證實(shí)成功獲取所需的GST-VP8*融合蛋白。為后續(xù)研究VP8*與HBGA的結(jié)合模式奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。輪狀病毒VP8*與唾液HBGA的結(jié)合方式采用ELISA法進(jìn)行檢測。選取84份配體唾液進(jìn)行體外結(jié)合實(shí)驗(yàn),其中分泌型A型22份、B型17份、O型33份,AB型3份,非分泌型(N)9份。根據(jù)梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取RVP[8], P[4] GST-VP8*蛋白10μg/ml為最佳反應(yīng)濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：P[8] GST-VP8*結(jié)合分泌型HBGA的OD均值分別為A=1.082, B=0.486, AB=0.590,O=1.151,即其與HBGA的結(jié)合能力為OAABB,而與非分泌型不結(jié)合。與其相類似,P[4]GST-VP8*結(jié)合分泌型HBGA的OD均值分別為A=0.348, B=0.157, AB=0.186,0=0.334,即其與HBGA結(jié)合能力為AOABB,同樣的表現(xiàn)為與非分泌型不結(jié)合。就兩者而言,RV P[8]較P[4]GST-VP8*蛋白結(jié)合HBGA能力強(qiáng)。該結(jié)果進(jìn)一步闡明了RV感染與HBGA結(jié)合模式。P[8]、P[4]均能結(jié)合分泌型人群,且P[8]具有更強(qiáng)結(jié)合能力(分泌型人群占總?cè)巳?0%以上),這很好地解釋P[8]和P[4]能成為RV的主要流行株,而P[8]最為流行的原因。綜合以上研究結(jié)果,我們首次在中國臨床人群中證實(shí)輪狀病毒感染與HBGA分泌型顯著相關(guān),并通過建立體外1RV GST-VP8*/HBGA結(jié)合模型,證實(shí)P[8]和P[4]均只結(jié)合HBGA分泌型,而與非分泌型不結(jié)合。該結(jié)果初步證明了我們提出的RV和NoV胃腸炎異病同證的物質(zhì)基礎(chǔ)可能與HBGA相關(guān)的理論假說,為今后開展中醫(yī)異病同證的證本質(zhì)研究提供示范作用,還為HBGA作為RV的受體研究指明了方向。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒 VP8~* HBGA 證本質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 前言14-25
• 1 病毒性胃腸炎主要病原體的研究概況14-15
• 2 輪狀病毒和諾如病毒“異病同證”的共同受體基礎(chǔ)研究設(shè)想15-17
• 3 輪狀病毒和諾如病毒的受體研究現(xiàn)狀17-21
• 4 HBGA受體的發(fā)現(xiàn)21-23
• 5 論文的研究目的和方法23-25
• 第二章 輪狀病毒胃腸炎與HGBA相關(guān)性的流行病學(xué)研究25-40
• 1 材料25-28
• 2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 3 結(jié)果31-37
• 4 討論37-40
• 第三章 輪狀病毒主要流行株P(guān)[8]、P[4]重組GST-VP8~*蛋白的表達(dá)40-55
• 1 材料40-41
• 2 實(shí)驗(yàn)方法41-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-55
• 第四章 重組GST-VP8~*蛋白與唾液HBGA的結(jié)合方式研究55-61
• 1 材料55
• 2 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 3 結(jié)果56-59
• 4 討論59-61
• 全文小結(jié)61-63
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 中英文縮略詞表68-69
• 綜述69-81
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 攻讀學(xué)位期間成果81-82
• 致謝82-83

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本文編號：524992