補體—中性粒細胞反饋的炎癥應答在過敏性紫癜中的作用機制研究

發(fā)布時間：2017-07-03 11:23

本文關鍵詞：補體—中性粒細胞反饋的炎癥應答在過敏性紫癜中的作用機制研究

【摘要】：研究背景過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura, HSP)又稱許蘭-亨諾紫癜,是一種常見的異質(zhì)性、炎癥性和自身免疫性皮膚血管炎癥,其主要病理改變?yōu)檎嫫\層的白細胞破碎、血管內(nèi)皮細胞腫脹、中性粒細胞浸潤等。臨床結果顯示,過敏性紫癜多發(fā)于三至十歲的兒童。過敏性紫癜發(fā)病較急,通常是先看到皮膚紫癜,大多開始出現(xiàn)踝關節(jié)周圍,雙側(cè)小腿,病情加重時,患兒手臂,胸部和雙下肢有瘀點、瘀斑。紫癜的特征是大小不等,呈紫紅色,壓之不退色。紫癜的特征是高出皮膚,大小不等,呈紫紅色,壓之不退色。通常為1-2周消退,但經(jīng)常發(fā)作或持續(xù)數(shù)周,數(shù)月消退。其次為關節(jié)疼痛,約1／3至2/3患兒出現(xiàn)關節(jié)紅腫疼痛。多見于踝關節(jié),膝關節(jié),甚至有些患兒出現(xiàn)關節(jié)積液。特點是關節(jié)腫脹,消退后不留后遺癥。也有少數(shù)患兒臍痛,嘔吐,或便血,腸套疊。而30%左右的兒童會出現(xiàn)腎損害,如血尿,蛋白尿或泌尿管炎,更為嚴重的表現(xiàn)稱為腎型,一般發(fā)生在2至4周后。腎型過敏性紫癜參差不齊,大多數(shù)較輕,少數(shù)可出現(xiàn)腎功能衰竭。臨床診斷表明,過敏性紫癜患者的中性粒細胞數(shù)量有著明顯上升。中性粒細胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用。中性粒細胞來源于骨髓,形成特征是具有分葉形或桿狀的核,胞漿內(nèi)含有大量既不嗜堿也不嗜酸的中性細顆粒。這些顆粒多是溶酶體,內(nèi)含髓過氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性水解酶等豐富的酶類,與細胞的吞噬和消化功能有關。中性粒細胞表面表達IgGFc受體,多是中親和力的FcyRⅡ和低親和力的FcyRⅢ,有時受細胞因子的誘導也可表達高親和力的FcRⅠ;還表達補體片段C3b和C4b以及某些特殊因子的受體。表面受體與相應配體作用后,可以活化中性粒細胞某方面的特殊功能。中性粒細胞在血液的非特異性免疫系統(tǒng)中起重要作用,它對微生物病原體,特別是在化膿性細菌入侵的第一線,當出現(xiàn)炎癥,并將它們吸引到炎癥趨化部位。中性粒細胞是通過糖酵解供能,它能夠在缺氧腫脹,血流不暢的條件下生存,其細胞膜的存在,破壞這里形成附近組織的細菌細胞毒性。因為中性粒細胞中含有大量的溶酶體酶,所以能夠吞噬細菌和組織碎片進入細胞內(nèi)從而將其分解并消除,防止病原微生物在體內(nèi)的擴散。中性粒細胞的崩解,使得溶酶體酶的釋放,以溶解所有的周圍組織,并形成膿腫。當人體受到急性損傷或出現(xiàn)化膿性細菌感染時,將有大量的中性粒細胞的聚焦到化膿位點,骨髓的造血能力增強,機體表現(xiàn)為外周血中性粒細胞顯著增加,局部死亡的白細胞和受累細胞液化形成膿汁。中性粒細胞以其龐大的數(shù)量和迅速的行動發(fā)揮抗感染和創(chuàng)傷修復的作用,當中性粒細胞缺陷時,機體容易發(fā)生化膿菌感染和創(chuàng)傷修復緩慢。諸多研究結果表明,中性粒細胞的炎癥應答在過敏性紫癜中發(fā)揮十分重要的作用,但補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調(diào)控在過敏性紫癜中的作用機制究竟是怎樣的還不是特別清楚,于是本課題就探討補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答在過敏性紫癜中的作用機制問題展開研究。研究目的(1)以干姜、蓽茇、胡椒水煎劑灌胃的方法構建過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura, HSP)動物模型；(2)通過比較模型組和正常組動物外部皮膚特征,觀察造模是否成功；(3)通過比較模型組和正常組動物體溫、飲食量、飲水量的變化,觀察模型組和正常組動物在致敏前后一般情況的變化；(4)通過比較模型組和正常組動物致敏前后血液、尿液常規(guī)變化,觀察模型組和正常組動物在致敏前后常規(guī)指標的改變；(5)比較模型組和正常組動物ROS水平、炎性因子水平、補體水平的變化,觀察模型組和實驗組動物在致敏前后所激發(fā)的炎癥反應的改變；(6)采用免疫組織化學染色方法比較模型組和對照組病理學方面的改變觀察兩組動物在致敏前后病變情況。根據(jù)以上指標的觀測來探討補體-中性粒細胞反饋的炎癥應答調(diào)控在HSP中的作用機制。研究方法取24只健康清潔級新西蘭兔(購自于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗中心,兔齡4月,雌雄各12只,體重2.2-3.0kg。將白兔按照體重隨機編號分為兩組,正常組和模型組各12只,雌雄各半。動物飼養(yǎng)于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物中心,溫度18-25℃,相對濕度40%-60%,光暗照明時間各12小時,每籠1只,自由進食和飲水。實驗動物操作經(jīng)動物使用管理委員會批準。將干姜、蓽茇、胡椒水煎劑(購于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)用1：1：1的比例配置成終濃度為15g/100 ml的液體溶液,在實驗開始前兩周,正常組兔子給予200g/只/天普通飼料；模型組兔子則予以飼料的基礎之上灌胃1 ml上述藥液,每日1次,正常組用等量生理鹽水灌胃,其他條件盡可能保持一致。另外,模型組動物還采取腹腔注射的方式加用卵白蛋白-弗氏佐劑1ml/只／天,連續(xù)3周,以達到連續(xù)抗原刺激致敏的目的,正常組動物注射等量生理鹽水。腹腔注射3周之后,模型組動物再通過耳緣靜脈注射0.5 ml濃度為10 mg/ml的卵白蛋白生理鹽水,背部皮膚剪毛皮下分5個位置點注射0.3%卵白蛋白生理鹽水0.2 ml。在抗原沖擊激發(fā)過敏反應之后,觀察每點皮膚局部紅腫的情況以驗證模型是否構建成功。比較兩組兔的飲食、飲水量、體溫、血液常規(guī)和尿液常規(guī)變化及氧自由基(Reactive oxygen species, ROS)、炎性因子和補體成分的改變,同時以N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine, NAC)和過氧化氫(H202)干預ROS水平,并觀察上述指標的變化。研究結果模型組動物在激發(fā)過敏后,體溫明顯升高,精神狀態(tài)萎靡、運動量減少,飲水量和飲食量均較致敏前顯著降低(P0.05),而這一現(xiàn)象在正常組動物中未發(fā)現(xiàn);對正常組和模型組動物皮膚組織進行HE染色,可觀察到模型組相比于正常組出現(xiàn)明顯的病理學改變,這些病理變化在ROS促進的模型組中更為嚴重,但在ROS抑制組中,HE染色結果顯示皮膚組織的損傷程度得以明顯改善；而且模型組動物相比于正常組動物的血液常規(guī)指標WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明顯升高,RBC、HGB、EOS和EOS%含量顯著降低(P0.05),而MCH和PLT則無明顯變化(P0.05)；模型組動物的尿液出現(xiàn)拉絲、氣味大的情況,其中66.67%出現(xiàn)尿蛋白陽性、58.33%出現(xiàn)尿紅細胞、25%白細胞陽性；另外,模型組動物的ROS水平、炎性因子水平、TGF-p、補體及TNF-a水平也均明顯升高；在ROS抑制劑NAC處理之后,上述指標水平明顯降低(P0.05),而在應用ROS激動劑H202處理之后,這些指標卻明顯加劇升高(P0.05)。研究結論本課題首次使用大耳白兔模型研究HSP的具體致病機理,通過卵白蛋白和弗氏完全佐劑持續(xù)抗原刺激以激發(fā)過敏反應來構建HSP模型,以期為研究HSP的致病機制提供切實可行的實驗模型和研究載體,并深入探討活化和抑制ROS情況下中性粒細胞介導的炎性反應的應答調(diào)控變化。本研究結果顯示,在HSP模型兔中,炎性因子IL-2, IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α的水平明顯升高,而且在ROS抑制情況下,這些炎性因子的水平也得以降低,而ROS激動的條件下,炎癥反應更為顯著,充分表明拮抗機體的ROS水平,能夠減弱中性粒細胞介導的炎癥反應應答。而且,在炎癥反應發(fā)生強度較大的情況下,模型兔的血液常規(guī)指標,如WBC、MCHC、NEU、NEU%等水平也出現(xiàn)明顯異常改變以適應機體內(nèi)的炎性應激反應,進而表現(xiàn)為模型兔的精神狀態(tài)不佳、食欲下降和運動量減少等癥狀。而且,HE染色也可明顯觀察到模型兔的皮膚組織明顯的病理改變在ROS抑制情況下能夠得到有效的改善,提示抑制ROS的水平不僅可以改善HSP兔的炎性指標,還能減輕疾病癥狀和病理表型。在模型兔中的補體C3、C4和C5的水平出現(xiàn)明顯升高,提示補體系統(tǒng)在HSP發(fā)生過程中被活化,更為重要的是,抑制了ROS的水平能夠減弱補體的活化程度,減輕炎癥反應,表明補體-ROS反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了HSP的形成和進展。研究還采取了NAC和H202雙向調(diào)控ROS水平從正反兩方面以證實了干預ROS能夠抑制HSP的發(fā)生和進展。結果充分表明,在臨床實踐中應用ROS的抑制劑可能對改善HSP的疾病癥狀、控制患者炎癥反應和促進預后有積極的作用。
【關鍵詞】：過敏性紫癜 補體 中性粒細胞 炎癥應答
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R725.5
【目錄】：