本文關(guān)鍵詞：miR-26a對胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成肺表面活性物質(zhì)的影響及其機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome,RDS)是新生兒期常見危重癥之一,有較高的發(fā)病率和病死率,也是導(dǎo)致嬰幼兒期慢性肺疾病的主要原因。盡管采用了類固醇產(chǎn)前預(yù)防性治療和外源性肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant,PS)替代治療,RDS的發(fā)生率及病死率雖有較為顯著下降,但目前其發(fā)病率及死亡率仍較高,一些重度RDS患兒臨床療效仍不盡如人意。因此,多年來RDS的防治一直是新生兒學(xué)科研究熱點(diǎn)。近年來,臨床醫(yī)學(xué)、流行病學(xué)及生物化學(xué)都充分證明RDS是由基因突變、嚴(yán)重感染、缺氧等多種內(nèi)外因素相互作用、共同參與的。這些因素可直接損傷II型肺泡上皮細(xì)胞,也可通過炎癥反應(yīng)引起肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷而導(dǎo)致血管壁通透性增加,血漿及纖維蛋白原滲出引起肺泡透明膜形成,致使原發(fā)性或繼發(fā)性PS分泌不足。迄今為止,許多因素的作用機(jī)制尚不十分清楚,進(jìn)一步探討RDS的發(fā)病機(jī)理是防治該疾病的根本途徑。最新研究顯示,micro RNAs(mi RNAs)可能參與調(diào)節(jié)了幾乎全部的細(xì)胞機(jī)制,在許多疾病中mi RNAs均有表達(dá)變化并參與了這些疾病的發(fā)病機(jī)制。目前,針對mi RNAs的研究主要集中于癌癥領(lǐng)域,而在RDS領(lǐng)域的研究中尚未見有關(guān)mi RNAs的報道。我們課題組前期進(jìn)行了胎鼠肺組織肺發(fā)育晚期不同時間點(diǎn)mi RNAs微陣列分析,發(fā)現(xiàn)mi R-26a有差異性表達(dá)且隨時間推移表達(dá)逐漸上調(diào)。另外,我們通過對早產(chǎn)兒RDS組和正�；純航M血中mi RNAs微陣列分析也顯示兩組mi R-26a表達(dá)有顯著性差異,RDS組血中mi R-26a表達(dá)顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn),mi R-26a基因在人類,大鼠,獼猴等哺乳動物體內(nèi)高度保守,位于同一條染色體(Chr3)的有意義鏈,且已有研究證實它在腫瘤發(fā)生、器官發(fā)育、細(xì)胞增殖等生物過程中起著重要作用。因此,我們推測mi R-26a可能在肺發(fā)育及RDS發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮著一定的作用。本課題分為兩部分,第一部分對mi R-26a進(jìn)行生物信息學(xué)分析,從而初步明確其靶基因及作用通路。第二部分探討mi R-26a對胎鼠II型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AECII)合成肺表面活性物質(zhì)的影響及其機(jī)制研究。第一部分mi R-26a的生物信息學(xué)分析目的:對mi R-26a進(jìn)行靶基因預(yù)測及相關(guān)生物信息學(xué)分析,為mi R-26a靶基因的實驗驗證提供數(shù)據(jù)支持,并為深入研究mi R-26a在肺發(fā)育中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。方法:應(yīng)用Pubmed、Google等工具采用“mi R-26a”關(guān)鍵詞搜索有關(guān)mi R-26a的研究;應(yīng)用mi RBase獲取mi R-26a的序列,并分析其序列保守性;利用mi RNA靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)庫mi RGen2.0進(jìn)行mi R-26a的靶基因預(yù)測,選取Pic Tar、Target Scan S、DIANA LAB-Tar Base6.0數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO-analysis)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析(Pathway-analysis)。結(jié)果:已有的研究提示mi R-26a在腫瘤、細(xì)胞分化、器官發(fā)育、免疫系統(tǒng)等生物學(xué)過程具有重要作用。mi R-26a在多物種間高度保守。mi R-26a調(diào)控的靶基因存在于包括細(xì)胞膜、胞質(zhì)、胞核等各個細(xì)胞組分中,其生物學(xué)功能主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)修飾、細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性等;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集于Wnt信號通路,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta,TGF-beta)信號通路、p53信號通路等。結(jié)論:mi R-26a可能通過作用于BMP信號通路,Wnt信號通路,TGF-beta信號通路等在肺發(fā)育及新生兒呼吸窘迫綜合癥中發(fā)揮重要作用。第二部分mi R-26a對胎鼠II型肺泡上皮細(xì)胞合成肺表面活性物質(zhì)的影響及其機(jī)制研究目的:探討mi R-26a在胎鼠II型肺泡上皮細(xì)胞合成肺表面活性物質(zhì)中的作用以及機(jī)制。方法:采用體外合成mi R-26a前體對應(yīng)的基因組片段,定向插入GV264載體,在大腸桿菌中高效同源重組,獲得完整的重組穿梭質(zhì)粒,將其與攜帶了腺病毒大部分基因組的輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并擴(kuò)增出mi R-26a過表達(dá)腺病毒載體Ad-26a;采用胰酶聯(lián)合膠原酶消化肺組織,差速離心及反復(fù)貼壁法純化胎鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells II,AECII),進(jìn)行原代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長特點(diǎn)及形態(tài)特征,臺盼藍(lán)染色法判斷細(xì)胞活力,免疫熒光化學(xué)SP-C法檢測細(xì)胞的純度,透射電鏡對細(xì)胞進(jìn)行鑒定;隨后應(yīng)用Ad-26a感染原代培養(yǎng)的AECII,通過熒光顯微鏡下觀察AECII綠色熒光蛋白的表達(dá),利用定量RT-PCR技術(shù)檢測AECII中mi R-26a的表達(dá)情況,采用MTT檢測AECII的增殖情況,運(yùn)用定量RT-PCR和Western blot檢測SMAD1以及肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白如SP-B,SP-C的表達(dá)情況。結(jié)果:1.mi R-26a腺病毒過表達(dá)載體感染AECⅡ48h后,93%的細(xì)胞均表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。2.經(jīng)定量RT-PCR法檢測成熟mi R-26a的表達(dá)水平,結(jié)果顯示過表達(dá)mi R-26a組mi R-26a的表達(dá)水平較空載陰性對照組以及空白對照組顯著升高(P0.05),表明mi R-26a過表達(dá)載體構(gòu)建成功。3.RT-PCR結(jié)果顯示過表達(dá)mi R-26a組中SP-B、SP-C的核酸表達(dá)水平顯著下降,且Western Blot結(jié)果同時顯示SP-C的蛋白表達(dá)水平亦有顯著下降(P0.05),提示過表達(dá)mi R-26a抑制了AECII肺表面活性物質(zhì)的合成。MTT檢測顯示過表達(dá)mi R-26a對AECII細(xì)胞增殖無顯著影響(P0.05)。4.進(jìn)一步研究顯示過表達(dá)mi R-26a組中SMAD1的核酸表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P0.05)。結(jié)論:mi R-26a通過調(diào)節(jié)靶基因SMAD1的表達(dá),從而影響AECII中肺表面活性物質(zhì)的合成。提示mi R-26a可能參與調(diào)控肺泡II型細(xì)胞的發(fā)育以及肺泡表面活性物質(zhì)的生成,為進(jìn)一步研究RDS的發(fā)病機(jī)制提供一些依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miR-26a 靶基因 生物信息學(xué) 肺發(fā)育 miR-26a 肺表面活性物質(zhì) II型肺泡上皮細(xì)胞 胎鼠
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R722.1
【目錄】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-17
• 第一部分 miR-26a 靶基因的預(yù)測及生物信息學(xué)分析17-24
• 材料與方法17-18
• 結(jié)果18-22
• 討論22-24
• 第二部分 miR-26a對胎鼠II型肺泡上皮細(xì)胞合成肺表面活性物質(zhì)的影響及其機(jī)制研究24-48
• 材料和方法24-39
• 結(jié)果39-44
• 討論44-48
• 全文小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 附錄一 英文縮略詞67-68
• 附錄二：碩士在讀期間科研工作小結(jié)68-69
• 已發(fā)表文章69-73
• 致謝73

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本文編號：482741