本文關鍵詞：AMPK激活促自噬反應參與心肌慢性缺氧適應的作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是嬰幼兒常見的疾病之一,目前CHD整體的手術治愈率較以前已明顯改善,但紫紺型先天性心臟病(cyanotic congenital heart disease,CCHD)的手術死亡率仍然較高。慢性缺氧(chronic hypoxia)是大部分CCHD病的共有的病理生理過程。目前CCHD的心肌慢性缺氧適應的分子機制尚不清楚。因此,深入研究心肌細胞慢性缺氧適應的分子機制可為改善CCHD的臨床治療提供新的心肌保護策略。AMPK是廣泛存在于真核細胞的Ser/Thr蛋白激酶,已有研究證實,在慢性缺氧條件下,活化的AMPK參與心肌細胞能量代謝。新近研究表明,在腫瘤細胞中,活化的AMPK和自噬反應密切相關。我們推測:在心肌細胞慢性缺氧適應中,AMPK可能通過調(diào)節(jié)自噬對心肌細胞產(chǎn)生保護作用。本研究擬從下面三個方面進行驗證:1.檢測活化AMPK在慢性缺氧心肌組織中的表達水平;2.研究AMPK活化水平對心肌細胞慢性缺氧適應的影響;3.探討AMPK活化水平對慢性缺氧心肌細胞自噬水平的影響。研究方法:1.選用清潔級4-6周齡雄性SD大鼠24只,隨機將其平均分為常氧組和缺氧組。將缺氧組置入低壓艙(模擬海拔5000m,氣壓405mm Hg),常氧組正常飼養(yǎng)。同時喂養(yǎng)28d后,處死大鼠后迅速取出心臟并分離出右心室部分作為標本;入選第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院心血管外科2013年全年行手術矯治的先心病患兒24例,平均將其分為紫紺組和非紫紺組,于術中收集切除的右室流出道心肌組織作為標本。采用Western blot分別檢測p-AMPK在大鼠、人體缺氧和正常心肌組織中的表達水平。2.選用H9c2心肌細胞株,并將其分為常氧組、低氧組、阻斷組、激活組。將低氧組、阻斷組、激活組三組細胞置入缺氧培養(yǎng)箱3d(94%N2,5%CO2,1%O2),建立H9c2心肌細胞株慢性缺氧模型;常氧組置入細胞培養(yǎng)箱3d(74%N2,5%CO2,21%O2),對照培養(yǎng)。分別向阻斷組和激活組中加入AMPK特異性阻斷劑Compound C和激活劑AICAR,采用Western blot驗證活化AMPK的表達,流式細胞儀、TUNEL法檢測并評價心肌細胞凋亡情況,Hoechst染色觀察因細胞壞死引起的細胞核形態(tài)變化、LDH測定心肌細胞乳酸釋放率評價心肌細胞壞死程度。3.采用westernblot分別檢測常氧組、缺氧組、阻斷組和激活組lc3的表達水平。結果:1.ampk在正常和慢性缺氧組織中的激活水平westernblot結果顯示與正常心肌組織相比,缺氧心肌組織中p-ampk/ampk比值明顯增高:在人體心肌組織方面,紫紺組心肌組織ampk蛋白磷酸化水平和非紫紺組相比,明顯增加,p0.005;在大鼠心肌組織方面,慢性缺氧組sd大鼠心肌組織中ampk蛋白激活水平和常氧組相比,明顯增加,p0.005。2.ampk激活對慢性缺氧心肌細胞的保護作用(1)心肌細胞ampk激活水平驗證實驗中,westernblot結果顯示與低氧組相比,阻斷組ampk激活水平降低,p0.01;激活組ampk激活水平升高,p0.01。(2)與低氧組相比,阻斷組心肌細胞凋亡水平升高,與此同時,激活組心肌細胞凋亡水平降低。細胞流式術:與低氧對照組相比,ampk阻斷組凋亡細胞比例明顯增多,與此同時,ampk激活組凋亡細胞比例明顯減少。tunel實驗:與低氧對照組相比,ampk阻斷組tunel-陽性細胞比例增多(p0.05),與此同時,ampk激活組tunel-陽性細胞減少(p0.05)。(3)與低氧組相比,阻斷組心肌細胞壞死程度增高,與此同時,激活組心肌細胞壞死程度降低。hoechst染色:與低氧對照組相比,ampk阻斷組不正常核細胞比例明顯增多(p0.01),與此同時,ampk激活組不正常核細胞比例減少(p0.05)。ldh實驗:與低氧對照組相比,ampk阻斷組細胞乳酸釋放率明顯升高(p0.01),與此同時,ampk激活組細胞乳酸釋放率明顯降低(p0.05)。3.ampk激活對慢性缺氧心肌細胞自噬反應的影響westernblot結果顯示與心肌細胞低氧組相比,ampk阻斷組自噬水平(lc3Ⅱ/lc3Ⅰ)明顯降低,p0.01;ampk激活組自噬水平(lc3Ⅱ/lc3Ⅰ)明顯升高,p0.01。結論:1.紫紺型先心病和慢性缺氧sd大鼠的心肌組織中p-ampk/ampk比值與非紫紺型先心病和常氧sd大鼠的心肌組織相比明顯增高。提示慢性缺氧心肌組織中ampk激活水平明顯增加。2.慢性缺氧條件下培養(yǎng)h9c2細胞72h,加入compoundc阻斷ampk激活,h9c2細胞凋亡和壞死水平增高;加入AICAR促進AMPK激活,H9c2細胞凋亡和壞死水平降低。提示在心肌慢性缺氧適應中,AMPK激活對H9c2細胞具有一定的保護作用。3.慢性缺氧條件下培養(yǎng)H9c2細胞72h,加入Compound C阻斷AMPK激活,H9c2細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低;加入AICAR促進AMPK激活,H9c2細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高。提示AMPK激活促進H9c2細胞自噬反應可能是心肌細胞適應慢性缺氧的機制之一。
【關鍵詞】：AMPK 心肌慢性缺氧 自噬
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R726.5
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-17
• 1.1 選題緣由12
• 1.2 研究背景12-15
• 1.3 研究方法15-17
• 第二章 AMPK在慢性缺氧心肌組織中的激活水平17-26
• 2.1 材料與方法17-23
• 2.2 實驗結果23-24
• 2.3 討論24-26
• 第三章 AMPK激活對慢性缺氧心肌細胞的保護作用26-35
• 3.1 材料與方法26-30
• 3.2 實驗結果30-33
• 3.3 討論33-35
• 第四章 探討AMPK激活對慢性缺氧心肌細胞自噬水平的影響35-38
• 4.1 材料與方法35
• 4.2 實驗結果35-36
• 4.3 討論36-38
• 全文結論38-39
• 參考文獻39-43
• 文獻綜述 心肌代謝的慢性缺氧適應43-56
• 參考文獻49-56
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文56-57
• 致謝57

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本文編號：446507