目的:1.運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)探尋紫癜性腎炎熱毒傷絡(luò)證患兒全外顯子組變異位點(diǎn)信息,篩選致病突變基因;2.回顧性文獻(xiàn)研究,通過NCBI對(duì)候選基因進(jìn)行查閱驗(yàn)證,確定兒童紫癜性腎炎熱毒傷絡(luò)證的可能致病基因,為中醫(yī)臨床精準(zhǔn)治療提供新的視野和理論依據(jù)。資料與方法:本次實(shí)驗(yàn)對(duì)象由6例HSPN熱毒傷絡(luò)證患兒及6例健康兒童組成,采取病例對(duì)照二階段設(shè)計(jì),第一階段通過采集其外周靜脈血提取DNA,對(duì)樣本的全外顯子區(qū)域DNA進(jìn)行高效富集并進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)所得測(cè)序序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,最終得到與疾病相關(guān)的候選致病突變。第二階段通過查閱大量與候選基因相關(guān)的文獻(xiàn),并在NCBI中搜索研究候選基因,最終確定可能致病基因。結(jié)果:1.全外顯組測(cè)序主要能夠得到的信息是點(diǎn)突變,即單核苷酸多態(tài)性（SNP,singlenucleotide polymorphism）改變和插入缺失（INDEL,insertion-deletion）突變,對(duì)拷貝數(shù)變異（CNV,copy number variation）不敏感。2.12例樣本中共有51141個(gè)SNP變異位點(diǎn),其中經(jīng)SIFT、Polyphen、Mutation Taster和CADD... 

【文章來源】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)遼寧省

【文章頁數(shù)】：48 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

電泳檢測(cè)結(jié)果圖

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文-11-建庫和捕獲采用AgilentSureSelectHumanAllExonV6試劑盒，將外顯組DNA隨機(jī)打斷成小片段，經(jīng)修復(fù)和兩端加接頭制備DNA文庫。接頭文庫與探針（經(jīng)生物素標(biāo)記后）進(jìn)行液相雜交，再使用磁珠（帶鏈霉素）將外顯子捕獲，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格可測(cè)序(圖3)。具體操作步驟如下：圖3建庫流程2.3.1DNA片段化Covaris破碎儀將外顯組DNA隨機(jī)打斷成小片段，長(zhǎng)度180bp-280bp左右。2.3.2末端修復(fù)反應(yīng)片段化后的DNA存在5’或3’端突出，T4DNA聚合酶消化3’端突出，5’端被聚合酶補(bǔ)齊并加上磷酸基團(tuán)，通過AgencourtAMpureXP磁珠純化。2.3.33’端加“A”尾在3’末端加上單個(gè)腺苷酸“A”，可有效防止DNA平末端自連。2.3.4連接測(cè)序接頭DNA文庫兩端利用T4DNA連接酶加上接頭。2.3.5文庫片段篩選

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文-13-b.加入中性溶液、測(cè)序引物、四種熒光標(biāo)記的dNTP及聚合酶，使dNTP合成到共價(jià)鍵結(jié)合的DNA鏈上，每次循環(huán)只能增加一個(gè)堿基，沖掉多余dNTP、酶等，在顯微鏡下進(jìn)行激光掃描，根據(jù)熒光標(biāo)記，通過互補(bǔ)原理推測(cè)模板堿基；c.每完成一個(gè)循環(huán)都要加試劑，切掉疊氮鈉基團(tuán)和熒光基團(tuán)，暴露3’端羥基，同上操作，再次加入dNTP及酶，新的一個(gè)堿基延長(zhǎng)完成，再次沖掉多余dNTP、酶，在顯微鏡下激光掃描，推測(cè)堿基……如此循環(huán)，直到得到足夠所需堿基。5生物信息分析再得到原始序列后，參考GRCh37/hg19基因組分析序列（圖4），大致包括三個(gè)部分：1)質(zhì)量評(píng)估：從測(cè)序錯(cuò)誤率、數(shù)據(jù)量和比對(duì)率三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估，若不符合標(biāo)準(zhǔn)需重新建庫或加測(cè)。2)變異檢測(cè)：若符合標(biāo)準(zhǔn)，則對(duì)樣本進(jìn)行變異檢測(cè)，包括SNP、InDel、CNV，并注釋。3)變異位點(diǎn)的篩選及疾病相關(guān)性預(yù)測(cè)：對(duì)篩選出的變異位點(diǎn)，通過分析其變異致病性、富集分析與表型關(guān)聯(lián)分析，篩選出HSPN外顯組有害變異位點(diǎn)或基因。圖4生物信息分析5.1數(shù)據(jù)質(zhì)量控制5.1.1原始序列數(shù)據(jù)利用Illumina測(cè)序?qū)⒃紨?shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為測(cè)序序列，即RawData。5.1.2測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)評(píng)a.原始數(shù)據(jù)篩選：精細(xì)過濾rawread，得到cleanreads。流程如下：刪除接頭序列；若不明堿基信息比例大于10%，去掉；若低質(zhì)量堿基數(shù)達(dá)到一半，去除。

【參考文獻(xiàn)】：
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