本文關(guān)鍵詞：一種防治柯薩奇病毒感染的新方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柯薩奇病毒(Coxsackie Virus,CV)是一種人類病毒,其歸屬在小RNA病毒科(Picornaviridas)中的腸道病毒屬(Enterovirus,EV)。本研究中用到的是柯薩奇病毒的一種很重要的亞型之一,柯薩奇病毒B組3型病毒(coxsackievirus B3,CVB3)。它在臨床上能引起急慢性心肌炎和胰腺炎,發(fā)病率和病死率很高,特別是對于嬰幼兒及新生兒來說是高易感疾病[1],新生兒及幼兒的病患較多,嚴重威脅著嬰幼兒的健康及生存。雖然成人患病相對較少,但是一旦發(fā)病,同樣非常嚴重,而且至今沒有特效的藥物或防治措施。因此,本研究針對CVB3感染的防治策略進行了探索,希望能探究出一條新的比較有效的防治途徑。本研究首先用基因合成、拼接等分子生物學(xué)實驗方法對天然Caspase-3進行了改造,設(shè)計出了含3C蛋白酶酶切位點的Caspase-3的基因,成功構(gòu)建了3C蛋白酶.重組Caspase-3細胞凋亡通路,利用3C蛋白酶的酶切活性在細胞內(nèi)激活Caspase-3信號凋亡通路,從而誘導(dǎo)感染細胞發(fā)生凋亡。該工作分別構(gòu)建了真核表達載體,即質(zhì)粒、腺病毒表達載體和慢病毒表達載體,遞送入哺乳細胞內(nèi),檢測了其表達產(chǎn)物及細胞毒性。之后分別在哺乳動物細胞及Balb/c乳鼠上進行防治CVB3感染效果的驗證。結(jié)果顯示,重組Caspase-3對細胞感染CVB3具有保護作用,并且對Balb/c乳鼠感染CVB3也具有保護作用。同時,為了這條途徑最終能應(yīng)用于人類病毒感染的防治,以求找出最佳的基因載體能起到更好的防治病毒的效果。我們對Caspase-3進一步地改造,成功構(gòu)建了質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-recombination-signal peptide-caspase-3-6Aa(以下簡稱為p-rc-sig-6),又相繼獲得了含有改造Caspase-3的基因的腺病毒基因載體Ad-recombination-Caspase-3-6Aa( 以下簡稱為Ad-rc-6)和Ad-recombination-Caspase-3-8Aa(以下簡稱為Ad-rc-8)及慢病毒基因表達載體LV-recombination-signal peptide-Caspase-3-6Aa(以下簡稱為LV-rc-sig-6)。我們首先在哺乳動物細胞上進行了質(zhì)粒、腺病毒基因載體及慢病毒基因載體的表達驗證及抑制病毒感染的驗證,繼而又在乳鼠身上進行了腺病毒基因載體及慢病毒基因載體抑制病毒感染的驗證,證實了這條通路是可行的,并且還具有廣泛的實用性。我們在此做出了一些探索,希望能為以后這條通路應(yīng)用于臨床實驗提供一些參考。這條通路的提出,為CVB3感染的防治及其治療藥物的研發(fā)提供了新的途徑和思路,同時也為其它病毒的防治方法提供了借鑒意義,具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：柯薩奇病毒 防治 3C蛋白酶 caspase-3 基因載體 凋亡信號通路
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-21
• 1 病毒與宿主的相互作用11-12
• 2 柯薩奇病毒概述12-13
• 3 Caspase-3概述13-15
• 4 3C蛋白酶概述15-16
• 5 防治CVB_3感染的研究現(xiàn)狀16
• 6 基因載體應(yīng)用概述16-17
• 7 本課題的研究內(nèi)容和意義17-21
• 第一章 質(zhì)粒p-rc-sig-6、腺病毒Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6基因載體的構(gòu)建21-35
• 1.1 材料、試劑及儀器21-24
• 1.1.1 引物、載體、質(zhì)粒21-22
• 1.1.2 培養(yǎng)基22-23
• 1.1.3 主要試劑及耗材23
• 1.1.4 主要溶液23
• 1.1.5 儀器設(shè)備23-24
• 1.2 研究方法24-31
• 1.2.1 p-rc-sig-6表達載體的構(gòu)建24-31
• 1.3 研究結(jié)果31-32
• 1.3.1 獲得了重組質(zhì)粒p-rc-sig-631-32
• 1.4 本章小結(jié)32
• 1.5 討論32-35
• 第二章 上述3類基因載體的表達檢測、對細胞活性的影響以及對細胞感染CVB_3的防治效果的研究35-57
• 2.1 材料、試劑及儀器35-37
• 2.1.1 表達載體、qPCR引物、菌株、細胞35-36
• 2.1.2 培養(yǎng)基和胰酶36
• 2.1.3 主要試劑及耗材36
• 2.1.4 主要溶液36-37
• 2.1.5 儀器設(shè)備37
• 2.2 研究方法37-43
• 2.2.1 Hela細胞培養(yǎng)37
• 2.2.2 凍存細胞株37-38
• 2.2.3 復(fù)蘇細胞株38
• 2.2.4 細胞總RNA的提取及純化38-39
• 2.2.5 反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)39-40
• 2.2.6 Real-time實時熒光定量PCR40-41
• 2.2.7 細胞轉(zhuǎn)染41-42
• 2.2.8 CVB_3病毒的擴增及濃縮42
• 2.2.9 CVB_3病毒的滴度測定42-43
• 2.2.10 CVB_3病毒感染細胞43
• 2.3 研究結(jié)果43-53
• 2.3.1 質(zhì)�；蜉d體p-rc-6,p-rc-sig-6導(dǎo)入Hela細胞后的轉(zhuǎn)錄檢測43-44
• 2.3.2 腺病毒基因載體Ad-rc-6和Ad-rc-8導(dǎo)入Hela細胞后的轉(zhuǎn)錄檢測44-45
• 2.3.3 慢病毒載體LV-rc-sig-6導(dǎo)入Hela細胞后的轉(zhuǎn)錄檢測45-46
• 2.3.4 轉(zhuǎn)進腺病毒載體Ad-rc-6的Hela細胞的顯微照片46-47
• 2.3.5 轉(zhuǎn)進慢病毒載體LV-rc-sig-6的Hela細胞的顯微照片47
• 2.3.6 質(zhì)粒p-Cas-3,p-rc-6,p-rc-8的轉(zhuǎn)染對Hela細胞活性無影響47-48
• 2.3.7 腺病毒載體Ad-rc-6和Ad-rc-8的導(dǎo)入對Hela細胞活性無影響48-49
• 2.3.8 慢病毒載體LV-rc-sig-6的導(dǎo)入對Hela細胞活性無影響49-50
• 2.3.9 計算得出了CVB_3病毒的滴度50-51
• 2.3.10 質(zhì)粒p-rc-6和p-rc-8具有保護細胞群的作用51-52
• 2.3.11 腺病毒載體Ad-rc-6和Ad-rc-8具有保護細胞群的作用52-53
• 2.4 本章小結(jié)53
• 2.5 討論53-57
• 第三章 腺病毒基因載體Ad-rc-6和Ad-rc-8及慢病毒LV-rc-sig-6對乳鼠感染CVB3的防治效果57-69
• 3.1 材料、試劑及儀器57-58
• 3.1.1 病毒,基因載體及實驗動物57
• 3.1.2 實驗耗材57-58
• 3.1.3 實驗環(huán)境及設(shè)備58
• 3.2 研究方法58-59
• 3.2.1 腹腔注射腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.2 口腔灌胃腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8及CVB_358
• 3.2.3 腹腔注射慢病毒載體LV-precas3-c6及CVB_358-59
• 3.3 研究結(jié)果59-65
• 3.3.1 建立了CVB3感染乳鼠的模型59-60
• 3.3.2 腺病毒載體Ad-rc-6及Ad-rc-8的轉(zhuǎn)導(dǎo)能幫助乳鼠防御CVB_3感染60-63
• 3.3.3 慢病毒載體LV-precas3-c6的轉(zhuǎn)導(dǎo)能幫助乳鼠防御CVB_3感染63-65
• 3.4 本章小結(jié)65
• 3.5 討論65-69
• 結(jié)論69-71
• 附錄71-73
• 參考文獻73-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章79-81
• 致謝81-82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 關(guān)鵬;石振華;李亞青;王娜;;鐵死亡:一種新的細胞死亡方式[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2013年02期

2 賈林濤,于翠娟,許彥鳴,趙晶,高下,張淼麗,王成濟,楊安鋼;GFP共表達檢測重組型Caspase-3對HeLa細胞凋亡的誘導(dǎo)作用[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2001年03期

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5 董雅潔;高維娟;;bcl-2、bax、caspase-3在細胞凋亡中的作用及其關(guān)系[J];中國老年學(xué)雜志;2012年21期

  本文關(guān)鍵詞：一種防治柯薩奇病毒感染的新方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：327186