本文關(guān)鍵詞：檢測五種腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR方法的建立和2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病原譜調(diào)查，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),全球每年約有20億腹瀉病例,較差的衛(wèi)生狀況導(dǎo)致發(fā)展中國家腹瀉更為普遍。2000年至2010年全球兒童死亡病因統(tǒng)計(jì)分析,腹瀉疾病是繼肺炎和圍產(chǎn)期疾病之后導(dǎo)致5歲以下兒童死亡的第三大原因[¨。全球腹瀉致死率不斷下降,但是腹瀉發(fā)病率仍然很高。在發(fā)展中國家,腹瀉仍然是引起死亡和傷殘的主要原因之一[2]。在我國,感染性腹瀉在法定傳染病中報告發(fā)病率位居前3位。作為公共衛(wèi)生問題之一的感染性腹瀉仍然是一類全球性的、危害很大的疾病,不可掉以輕心。建立快速檢測和篩查腹瀉病原譜的方法,研究腹瀉病病原體的種類和流行病學(xué),將有助于控制腹瀉病原體在全球范圍內(nèi)的流行與傳播。腹瀉的定義為每日排便3次或以上,且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、粘膿便或膿血便等),可伴有嘔吐、發(fā)熱和呼吸道癥狀等臨床癥狀。腹瀉病因復(fù)雜,可分為感染性腹瀉和非感染性腹瀉。與感染性腹瀉相關(guān)的病原體種類繁多,包括多種細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌,其中以前兩類病原體最為常見。常見細(xì)菌感染性腹瀉病原體有致病性大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、沙門氏菌、彎曲菌、志賀氏菌、霍亂弧菌和艱難梭菌等；常見病毒感染性腹瀉病原體有輪狀病毒、諾如病毒G Ⅰ/GⅡ型、星狀病毒、腺病毒40/41型和札如病毒等。早期、快速、高通量及特異靈敏的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)對腹瀉病原體的鑒定、臨床診斷與正確用藥、盡快控制病情及流行病學(xué)研究均極為重要。腹瀉病原體檢測方法中,經(jīng)典的病原體檢測技術(shù)為分離培養(yǎng)技術(shù)。細(xì)菌、病毒的分離,培養(yǎng)周期長,不同細(xì)菌、病毒所需培養(yǎng)條件不同,操作繁瑣,對技術(shù)人員要求高,某些病毒目前沒有合適的培養(yǎng)方法；免疫學(xué)檢測技術(shù),包括乳膠凝集試驗(yàn)、酶免疫測定、放射免疫測定、免疫膠體金法,免疫層析法等,已廣泛應(yīng)用于臨床檢測中,但其對特異性單克隆抗體準(zhǔn)確識別的嚴(yán)格要求及多數(shù)體系缺少集成性等限制了診斷的快速與高通量；分子生物學(xué)方法,能更準(zhǔn)確、靈敏地檢測標(biāo)本中的病毒核酸,尤其是低濃度的病毒感染,最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對病毒進(jìn)行基因型的研究,不會受到制備分型單克隆抗體的限制,對流行病學(xué)研究具有重要意義。上述的方法中,分子生物學(xué)檢測方法,其在靈敏度和特異性方面具有明顯的優(yōu)勢。并且,隨著基因芯片技術(shù)的逐漸成熟,由簡單的單一反應(yīng)只能擴(kuò)增并檢測一種核酸的PCR方法,逐漸發(fā)展為一次反應(yīng)能擴(kuò)增并檢測多種病原體核酸的多重RT-PCR方法。因此,利用一種特異、靈敏、高通量的檢測方法,以最大程度覆蓋檢測腹瀉病原體,將為腹瀉疾病的臨床治療和流行病學(xué)研究提供有效的參考。本研究包括以下三個部分：一、2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病原譜調(diào)查腹瀉病因復(fù)雜,其中與感染性腹瀉相關(guān)病原體種類繁多,包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲三大類。每類病原體包含了眾多的常見致病菌／病毒,例如沙門氏菌、彎曲菌、輪狀病毒和諾如病毒。對于腹瀉病因的診斷,依賴于臨床實(shí)驗(yàn)室對腹瀉糞便標(biāo)本的檢測。目前臨床常規(guī)檢測方法有細(xì)菌培養(yǎng)、病毒免疫膠體金法檢測和寄生蟲鏡檢,較少使用分子生物學(xué)方法。檢測存在耗時長,靈敏度和特異性不理想等缺點(diǎn)。而目前國內(nèi)外對于腹瀉病因的調(diào)查,由于檢測方法的局限,多集中于病毒或細(xì)菌某一類病原體的檢測報道。另外,據(jù)《廣州經(jīng)濟(jì)社會白皮書》報道,廣州于2013年底成為中國繼重慶、上海、北京和天津之后第五個千萬人口規(guī)模的城市。對于一個常住人口數(shù)巨大的城市而言,腹瀉暴發(fā)流行將會給社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來重大的負(fù)擔(dān)。同時,廣州地區(qū)對于腹瀉病因的研究尚不夠充分。因此,采用先進(jìn)的方法對本地區(qū)腹瀉病因進(jìn)行監(jiān)控是十分有必要的。我們收集了廣州市海珠區(qū)珠江醫(yī)院從2013年9月至2014年10月,共289份門診/住院腹瀉患者的糞便標(biāo)本,采用基于液相懸浮芯片技術(shù)的xTAGGastrointestinal Pathogen Panel (xTAG GPP)試劑盒檢測腹瀉糞便標(biāo)本。該試劑盒覆蓋檢測15種病原體,包括9種細(xì)菌(彎曲菌、沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、艱難梭菌毒素A/B、霍亂弧菌、0157型大腸桿菌、產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌、腸毒素型大腸桿菌)、3種病毒(A組輪狀病毒、諾如病毒G I型和GⅡ型、腺病毒40/41型)和3種寄生蟲(隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲、溶組織阿米巴)。并且,能在5小時內(nèi)得到檢測結(jié)果,實(shí)現(xiàn)了腹瀉病因的快速準(zhǔn)確診斷。通過xTAG GPP的檢測結(jié)果,分析廣州地區(qū)腹瀉病原譜構(gòu)成、病毒性病原優(yōu)勢流行株、細(xì)菌性/病毒性病原流行季節(jié)等情況。本研究中,總樣本陽性率為74.4%(215/289)。其中,細(xì)菌性腹瀉占47.4%,病毒性腹瀉占35.0%。細(xì)菌性腹瀉以沙門氏菌、彎曲菌和艱難梭菌感染為主,占89.0%；病毒性腹瀉以輪狀病毒、諾如病毒GII型感染為主,占92.1%。各種病原體檢測結(jié)果與臨床流行病學(xué)因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,細(xì)菌性腹瀉全年均可發(fā)生,呈炎熱季節(jié)高發(fā)的特點(diǎn),易感年齡段分布不明確；而病毒性腹瀉有明顯寒冷季節(jié)高發(fā)和1-3歲年齡段易感的特點(diǎn)。在臨床癥狀的差異上,細(xì)菌性腹瀉更容易出現(xiàn)糞便白細(xì)胞/紅細(xì)胞/隱血試驗(yàn)陽性,而病毒性腹瀉更容易發(fā)生嘔吐等并發(fā)癥。另外,對于病毒檢測陽性的標(biāo)本,進(jìn)行基因分型研究。G2P[8]型輪狀病毒、GⅡ.4型諾如病毒為優(yōu)勢流行株。本研究中腹瀉病原體呈現(xiàn)的流行病學(xué)特征與目前國內(nèi)外相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相符。二、檢測五種腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR方法的建立腹瀉病因的診斷對于臨床治療的開展與正確用藥至關(guān)重要。區(qū)分細(xì)菌性腹瀉和病毒性腹瀉,能有效提高臨床治療效果、避免濫用抗生素和給患者帶來不必要的經(jīng)濟(jì)損失。臨床實(shí)驗(yàn)室對于細(xì)菌性腹瀉的檢測,常規(guī)方法為腹瀉糞便培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)耗時長(約3～5天時間),且對操作人員的實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高。臨床實(shí)驗(yàn)室對于病毒性腹瀉的檢測,常規(guī)方法為免疫膠體金法。免疫法快速簡便,但是特異性和靈敏度尚不理想,且覆蓋病毒性病原譜有限,容易造成漏診�；谝合鄳腋⌒酒夹g(shù)的xTAG GPP,具有靈敏、特異、高通量的多重檢測功能。但由于其價格昂貴,臨床實(shí)驗(yàn)室無法常規(guī)開展。因此,我們想建立一種檢測病毒性腹瀉常見病原的多重RT-PCR方法,實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)驗(yàn)室對病毒性腹瀉的快速準(zhǔn)確診斷,或者結(jié)合免疫膠體金法檢測結(jié)果以最大可能排除病毒性腹瀉。建立的多重RT-PCR檢測可涵蓋的病原體包括——諾如病毒G Ⅰ型和G Ⅱ型、腺病毒、星狀病毒和札如病毒。選擇文獻(xiàn)報道的引物,進(jìn)行引物最佳退火溫度的優(yōu)化。通過對RT-PCR反應(yīng)體系中各物質(zhì)相對比例的調(diào)整,選擇最佳的體系配置建立多重RT-PCR。利用輪狀病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、沙門菌、志賀菌、彎曲菌、艱難梭菌、O157型大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌和嗜水氣單胞菌的菌(毒)株等非靶病毒核酸,進(jìn)行特異性驗(yàn)證。構(gòu)建五種病毒質(zhì)粒,倍比稀釋后進(jìn)行RT-PCR和多重RT-PCR對于靶病毒的檢測限實(shí)驗(yàn)和靈敏度比較。利用多重RT-PCR和多重檢測液相懸浮芯片試劑盒xTAGGPP、RT-PCR平行檢測107份標(biāo)本。因xTAG GPP不包含多重RT-PCR可檢測的星狀病毒和札如病毒,其檢測以RT-PCR為參考,以后兩者為參考方法評估多重RT-PCR對五種腹瀉相關(guān)病毒的檢測靈敏度、特異性以及與兩種方法的吻合度。研究結(jié)果表明,建立的多重RT-PCR方法與液相懸浮芯片、RT-PCR的檢測吻合度高,κ值分別為0.885和1.0。以液相懸浮芯片為標(biāo)準(zhǔn),多重RT-PCR檢測靈敏度為80.8%,特異度為100%。多重RT-PCR對五種病毒的檢測限為104copies/μL-106copies/μL。三、廣州地區(qū)2013-2014年星狀病毒和札如病毒感染性腹瀉基因型分析病毒性腹瀉的常見病原包括輪狀病毒、諾如病毒G Ⅰ型和G Ⅱ型、腺病毒40/41型、星狀病毒和札如病毒。目前,國內(nèi)外對于輪狀病毒、腺病毒和諾如病毒感染均有詳盡的流行病學(xué)調(diào)查資料。由于星狀病毒和札如病毒檢出率較低,兩者的流行病學(xué)報道尚不夠詳細(xì)。人星狀病毒(Human astrovirus, HAstV)屬于星狀病毒科哺乳動物星狀病毒屬。病毒基因?yàn)閱喂烧淩NA,基因組全長約7.0kb,全基因組有3個開放閱讀框(ORF)。根據(jù)衣殼蛋白的編碼基因可以將星狀病毒分為8個經(jīng)典基因型(HAstV——1～8)。札如病毒(Sapovirus, SaV)與諾如病毒同屬于杯狀病毒科,其為單股正鏈RNA病毒,基因組全長約7.5kb,含有2個ORF。根據(jù)VP1序列,札如病毒至少可以分為5個基因型(G Ⅰ～GV)。GⅠ型、GⅠ型、GⅣ型和GⅤ型主要感染人,而GⅢ型主要感染動物。本研究的目的是了解廣州地區(qū)腹瀉患者中星狀病毒和札如病毒感染的流行情況,分析其基因型特征。利用實(shí)驗(yàn)室建立的多重RT-PCR方法檢測星狀病毒、札如病毒、諾如病毒GI型/GII型和腺病毒。對于星狀病毒和札如病毒檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行測序比對,構(gòu)建進(jìn)化樹,分析優(yōu)勢流行亞型。收集2013年10月-2014年9月廣州市海珠區(qū)珠江醫(yī)院門診和住院病人腹瀉糞便樣本,提取糞便標(biāo)本核酸,進(jìn)行多重RT-PCR檢測。檢測結(jié)果顯示,273份糞便樣本中,星狀病毒陽性率為3.3%(9/273),檢出基因型為星狀病毒1型、2型、4型和8型。札如病毒陽性率為1.5%(4/273),基因型均為札如病毒G Ⅰ型。綜上,對2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病例信息和標(biāo)本的收集,并利用液相懸浮芯片試劑盒xTAG GPP檢測15種腹瀉相關(guān)病原體,初步得到廣州地區(qū)腹瀉病原譜構(gòu)成情況。對多重RT-PCR的臨床應(yīng)用評估表明,多重RT-PCR與液相懸浮芯片xTAG GPP對于臨床標(biāo)本檢測一致性好,可望成為高通量、快速、特異、靈敏適用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常見腹瀉相關(guān)病毒的多重檢測工具。利用建立的多重RT-PCR對廣州地區(qū)2013-2014年星狀病毒和札如病毒感染性腹瀉基因型分析,提示星狀病毒和札如病毒是引起人類腹瀉的重要病原體。
【關(guān)鍵詞】：腹瀉 液相懸浮芯片技術(shù) 多重RT-PCR 病毒 細(xì)菌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440;R725.7
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-22
• 第一章 2013年9月～2014年10月廣州地區(qū)腹瀉病原譜調(diào)查22-39
• 1.1 材料和方法22-29
• 1.2 結(jié)果29-35
• 1.3 討論35-38
• 1.4 小結(jié)38-39
• 第二章 檢測五種腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR方法的建立39-62
• 2.1 材料和方法39-54
• 2.2 結(jié)果54-60
• 2.3 討論60-61
• 2.4 小結(jié)61-62
• 第三章 廣州地區(qū)2013-2014年星狀病毒和札如病毒感染性腹瀉基因型分析62-72
• 3.1 材料與方法62-65
• 3.2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果65-70
• 3.3 討論70-71
• 3.4 小結(jié)71-72
• 全文總結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 縮略詞簡表78-79
• 致謝79-80
• 碩士研究生期間發(fā)表論文80-81

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本文編號：316768