本文關(guān)鍵詞：烏魯木齊縣2-14歲人群HBV病毒株變異及OBI生物標(biāo)志物研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討中、小學(xué)生(7-14歲)及學(xué)齡前兒童(2-6歲)乙型肝炎病毒隱匿性感染(occult hepatitis B virus infection OBI)后S基因片段變異位點與OBI發(fā)生的關(guān)系;4種miRNA表達譜與OBI發(fā)生的關(guān)聯(lián)性;初步探討miRNA用于早期診斷OBI的可行性。方法:用整群抽樣方法選擇烏魯木齊縣4所中、小學(xué)綜合性學(xué)校,對在校的學(xué)生采用酶聯(lián)免疫試劑法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光法進行乙肝HBsAg、抗-HBs兩項血清學(xué)指標(biāo)進行檢測,對檢測發(fā)現(xiàn)的HBsAg和抗-HBs 2項指標(biāo)均為陰性的469名中、小學(xué)生的一份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取HBV-DNA產(chǎn)物,利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增HBV-DNA S基因片段,對43份有目的條帶的PCR擴增產(chǎn)物進行HBV基因S區(qū)(544bp)序列測定。測序后建立HBV序列數(shù)據(jù)庫,并用MEGA 5軟件將測序結(jié)果與NCBI國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫協(xié)作組(INSDC,原Genbank)收錄的序列進行對比分析,以獲得HBV基因S區(qū)序列的核苷酸變異規(guī)律;基于S區(qū)基因片段的進化模型選擇,測定序列與INSDC收錄的參考序列建立進化樹,確定病毒的基因型,比較其基因型分布的差別,分析產(chǎn)生變異的核苷酸位點。40例序列測定成功的中、小學(xué)生按漢族,少數(shù)民族(包括漢族、哈族和回族)1:1匹配,符合匹配條件的有20名學(xué)生,這20名學(xué)生作為OBI研究對象。在整群抽樣調(diào)查后,隨機選取與OBI組年齡、性別和族別相匹配的20名健康學(xué)生和20名HBsAg陽性學(xué)生作為對照。共計60份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取RNA,轉(zhuǎn)錄為cDNA,繼而進行熒光定量PCR測定4種miRNA的相對表達量。用同樣的方法選擇4所幼兒園,對在園的學(xué)齡前兒童采用ELISA進行HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc 5項檢測,對259例HBsAg陰性血清用Promega公司的試劑盒提取HBV-DNA產(chǎn)物,進行PCR擴增HBV-DNA S基因片段,對發(fā)現(xiàn)的21份目的條帶進行測序。用上述方法獲得核苷酸變異規(guī)律,確定基因型。結(jié)果:469份中、小學(xué)生血樣標(biāo)本中用PCR擴增共發(fā)現(xiàn)43份HBV DNA陽性標(biāo)本。其中,40份測序成功,32例B基因型樣本均為adw2血清型,6例C基因型樣本5例為adrq+血清型,1例為ayw2血清型。2例D基因型樣本均為ayw2血清型。D基因型僅在哈薩克族學(xué)生中出現(xiàn)。S基因序列翻譯成對應(yīng)的氨基酸后分別發(fā)生I110L、S113T、K122R、T126I、F134Y、T143S、K159G和K160R突變。S基因MHR區(qū)氨基酸變異在性別、民族中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。4種miRNA在健康對照者與HBV感染者和健康對照者與OBI感染者血清中的表達,let-7c,miR-122和miR-150的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但miR-23b在血清中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外,OBI感染者中,let-7c,miR-23b,miR-122和miR-150在漢族和少數(shù)民族血清中的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。OBI感染者的血清miRNA表達與S基因MHR區(qū)氨基酸變異次數(shù)的相關(guān)關(guān)系均為負相關(guān)。let-7c,miR-122,mi R-150和miR-23b與基因序列MHR區(qū)變異的突變次數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別為-0.606,-0.902,-0.955和-0.897;P值分別為0.202,0.009,0.003和0.015.miR-122,miR-150,let-7c與S基因MHR區(qū)氨基酸變異次數(shù)顯著相關(guān)。在血清中表達有差異的3種miRNA區(qū)分OBI感染者和正常對照時,曲線下面積(Area under curve,AUC)為96.4%(靈敏性:92.6%,特異性:90.8%)。用受試者工作特征(ROC)曲線評價各miRNA時,體現(xiàn)出了一定的診斷價值。259份學(xué)齡前兒童血樣共發(fā)現(xiàn)21份HBV DNA陽性標(biāo)本,均測序成功。其中1例由于存在氨基酸插入,沒有檢測出具體基因型。其余20例樣本均為C基因型,其血清型均為adrq+亞型。S基因序列翻譯成氨基酸后分別發(fā)生I110L、S123T、T124S、T126I、T131N、F134Y和P142H突變。126位點和134位點氨基酸的變異在中、小學(xué)生與學(xué)齡前兒童的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:中、小學(xué)生及學(xué)齡前兒童隱匿性乙型肝炎病毒感染后S基因氨基酸存在不同頻率的變異情況。miRNA的表達量與S基因MHR區(qū)氨基酸變異的突變次數(shù)呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。3種mi RNA的表達量與OBI有關(guān),體現(xiàn)出了一定的診斷價值。
【關(guān)鍵詞】：隱匿性乙型肝炎病毒感染 氨基酸變異 microRNA 中、小學(xué)學(xué)生 學(xué)齡前兒童
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R725.1
【目錄】：

• 摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-18
• 內(nèi)容與方法18-28
• 1.研究對象18
• 1.1 抽樣對象18
• 1.2 中、小學(xué)生中OBI研究對象18
• 1.3 miRNA研究對象18
• 1.4 學(xué)齡前兒童OBI的研究對象18
• 2. 相關(guān)儀器與試劑18-21
• 2.1 巢式PCR擴增體系20
• 2.2 反轉(zhuǎn)錄體系制備20
• 2.3 熒光定量PCR反應(yīng)體系制備20
• 2.4 熒光定量PCR循環(huán)條件20-21
• 2.5 血清 miRNA 表達與基因序列變異位點的關(guān)聯(lián)性研究變量賦值方法21
• 3.試驗方法21-26
• 4.數(shù)據(jù)處理26
• 5.質(zhì)量控制26-28
• 結(jié)果28-39
• 討論39-45
• 小結(jié)45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻47-52
• 綜述52-65
• 參考文獻59-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文65-66
• 導(dǎo)師評閱表66

【參考文獻】

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本文編號：315271