2007年,本實驗室鄒永新等定位了一個X連鎖精神發(fā)育遲滯致病基因CUL4B,隨后對該基因的表達模式及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控、亞細胞定位和在細胞增殖中的作用進行了分析。CULAB屬于Cullin基因家族,該家族成員是泛素連接酶E3 （ubiquitin ligase enzymes）的重要組成部分,在蛋白的泛素化過程中發(fā)揮重要的功能。由于對CUL4B基因發(fā)揮功能的作用機制知之甚少,本研究采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析該基因表達產(chǎn)物CUL4B引起的蛋白表達譜的變化,進而探索其在相關(guān)生物過程中的可能作用機制。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)由于其高通量、高靈敏度、高精度的特點在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中受到了越來越多的青睞。在常規(guī)技術(shù)的基礎(chǔ)上,本研究對以二維電泳-質(zhì)譜（Two-dimensional electrophoresis-Mass Spectrometer,2 DE-MS）聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)部分流程進行了改進,包括樣品的制備,凝膠染色相應(yīng)的膠內(nèi)酶解等。在此基礎(chǔ)上,通過利用CULAB穩(wěn)定低表達及過表達HEK293體系,進行CULAB差異蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究。第一部分二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)組學(xué)部分流程優(yōu)化首先,本研究對二維電泳... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CUL4B穩(wěn)定低表達HEK293及其對照細胞系2.DE膠圖

HEK293和n五 NegHEK293及野生型HEK293間沒有顯著的蛋白水平在而 CUL4BHEK293和 miNegHEK293及野生型HEK293間有顯著差異，如圖2一所示。為明確CU以A低表達對Peroxj政xloxln蛋白水平是否也有與CUL4B相同的影響，本研究在野生型HEK293中，通過siRNA介導(dǎo)CUL4A低表達，并沒有發(fā)現(xiàn)Pero石r改foxin蛋白水平的累積(如圖2一3所示)。1汪2.驗證CUL4B低表達導(dǎo)致Perox]扮edoxin積累發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平為了明確Peroxiredoxin蛋白在CUL4B低表達細胞內(nèi)的累積是否是由于mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變，利用 Real.timePCR檢測了HEK293穩(wěn)篩細胞內(nèi) PeroxiredoxinmRNA水平的變化。結(jié)果顯示，在CUL4B低表達的HEK293細胞內(nèi)，Peroxiredoxinm丑NA水平和對照細胞沒有顯著差異，表明Perex

構(gòu)建穩(wěn)定過表達 cUL4BHEK293(pcDNA3.IA-cuL4BHEK293)及其對照細胞系 (pcDNA3.IAHEK293)。經(jīng)單克隆培養(yǎng)后，west。毛bfotting驗證CU拼B的表達，結(jié)果如圖2一所示，表明 pcDNA3.IA-cuL4BHEK293相對peDNA3.IAHEK293而言，CUL4B是高表達，即過表達細胞系構(gòu)建成功。CUL4Bcyc肺nH...陣P.ro勸Per喇redo地nmfe面幼nl，刁改in圖2一 westembfotting檢測過表達C硯哄 BHEK293體系中Peroxiredoxin和cyclinH蛋白表達水平FigureZ一 DetectiontheperoxiredoxinandCvclinHexpressionontheeffectof stablyovotxPressionofCUMBbyWestemblottlnginHEK293cells.


本文編號：3066442