目的 分別建立人冠狀病毒NL63(Human Coronavirus NL63)和人冠狀病毒HKU1( Human Coronavirus HKU1)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quanti- tative PCR,FQ-PCR)方法檢測并了解福州地區(qū)急性呼吸道感染(ARTI)患兒HCoV-NL63與HCoV-HKU1感染情況。 方法 分別設(shè)計(jì)HCoV-NL63多聚酶蛋白1a基因、HCoV-HKU1 pol基因的引物和Taqman探針。擴(kuò)增1a基因片段、pol基因片段并將其克隆到PMD18-T載體上,構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行敏感性、特異性試驗(yàn),重復(fù)性試驗(yàn)。用建立好的熒光定量PCR檢測收集到的151份臨床ARTI患兒標(biāo)本中兩種病毒的感染情況,對結(jié)果進(jìn)行比較分析。擴(kuò)增HCoV-NL63核衣殼蛋白N基因與包膜蛋白E基因,對其序列進(jìn)行初步分析。 結(jié)果 1、建立的FQ-PCR方法檢測HCoV-NL63,線性范圍為101 copies/μl～109copies /μl,批內(nèi)變異系數(shù)為0.9%,批間變異系數(shù)為1.6%。用建立的HCoV-NL63實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測2008-2009年度冬春季151例臨床標(biāo)本,共檢出陽性2例,陽性率為1.3%(2/151)。普通PCR法檢測結(jié)果與FQ-PCR檢測結(jié)果一致。 2、福州地區(qū)HCoV-NL63的N基因核苷酸序列,氨基酸序列與GenBank中登錄的原型株HCoV-NL63的N基因一致性均達(dá)97%以上,氨基酸序列與原型株有3個(gè)氨基酸的改變。HCoV-NL63的E基因核苷酸序列與GenBank中登錄的原型株一致性達(dá)99%以上,氨基酸序列與原型株完全相同。 3、建立的FQ-PCR方法檢測HCoV-HKU1,線性范圍為102copies/μl～109copies /μl,批內(nèi)變異系數(shù)為1.2%,批間變異系數(shù)為0.5%。用建立的HCoV-HKU1實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測151例臨床標(biāo)本,未檢出陽性標(biāo)本。但用本法檢測先前本實(shí)驗(yàn)室保存的2006-2007年度用普通RT-PCR檢測出的一份HCoV-HKU1陽性標(biāo)本,也顯示陽性。 結(jié)論 1、本研究建立的HCoV-NL63、HCoV-HKU1 FQ-PCR檢測方法靈敏度、重復(fù)性、特異性均較好,可用于臨床呼吸道標(biāo)本的檢測以及流行病學(xué)監(jiān)測。 2、福州地區(qū)HCoV-NL63的N基因、E基因均與原型株同源性高。 3、福州地區(qū)2008-2009年度冬春季急性呼吸道感染患兒中,存在比較低的HCoV-NL63感染率。150例ARTI患兒標(biāo)本中未檢測到HCoV-HKU1提示該病毒在本地區(qū)患兒中感染率更低。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下表現(xiàn)為單一特異明亮條帶，分子量約為526bp,見圖1。M:wide DNA ladder ; A,B: 1a-1 基因片段擴(kuò)增結(jié)果圖 1 1a-1 基因片段擴(kuò)增電泳圖二、重組質(zhì)粒測序結(jié)果用 HCoV-NL63 基因特異性的引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒 pGEMT-Easy-1a-1，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與 GenBank 進(jìn)行 BLAST 比較，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增的片段為1a-1 基因序列。部分測序圖如圖 2。

copies/μl濃度梯度，在ABI7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-2.867X+31.16（其中Y對應(yīng)Ct值，X為標(biāo)本拷貝數(shù)，圖3）和相應(yīng)的擴(kuò)增曲線（圖4）。相關(guān)系數(shù)（R2 ）為0.983，說明線性關(guān)系好。18

質(zhì)粒倍比稀釋濃度圖 3 熒光定量 PCR 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線五、方法學(xué)評價(jià)結(jié)果對建立的HCoV-NL631a-1基因的FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)1. 重復(fù)性試驗(yàn)1.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)對同一模板同時(shí)進(jìn)行 5 次重復(fù)測定，結(jié)果如圖 5。19
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2889383