原發(fā)性腎病綜合征(NS)是小兒常見的腎小球疾病,其中以微小病變(MCD)為主要病理類型,約占75%-90%,臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿,低蛋白血癥,水腫,高血脂,大部分患兒對糖皮質激素治療敏感,盡管在人類和動物模型中進行了廣泛研究,圍繞NS發(fā)病機制和蛋白尿形成機制以及糖皮質激素的治療機制仍不十分清楚。 自上世紀50年代以來,糖皮質激素開始用于治療兒童腎病綜合征,約90%的NS患兒對激素治療敏感,NS相關的死亡率由治療前的35%下降到3%,口服糖皮質激素開始成為治療兒童NS的一線用藥；臨床上雖然已經(jīng)進行了大量的臨床試驗和meta分析,探討針對兒童合適的治療策略,以期更合理的應用糖皮質激素的治療作用減少其相應的副作用,但是仍有約60%腎病綜合征患兒存在頻復發(fā),需要長期應用糖皮質激素,而長期激素治療可以誘發(fā)和加重感染,感染又可致疾病反復和死亡率增加,同時可以引起生長遲緩,免疫抑制,高血壓,抑制傷口修復,骨質疏松以及代謝紊亂等激素相關的副作用,給患兒及家長造成了很大的經(jīng)濟和心理負擔。因此明確蛋白尿的發(fā)生機制及糖皮質激素的治療作用機制仍是對兒童腎臟病工作者的挑戰(zhàn)。 1974年Shalhoub提出“可溶性介質假說”(soluble mediator hypothesis),指出微小病變腎病綜合征(MCNS)主要是由于免疫系統(tǒng)功能紊亂導致相關的細胞因子及炎癥介質分泌異常所致。圍繞這一假說,在人與NS模型中展開了很多研究,發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-a)等在NS患兒中表達增高,但在疾病緩解期則與正常組無差異；進一步動物實驗發(fā)現(xiàn),IL-8、TNF-α可以導致實驗動物產生蛋白尿；提示這些細胞因子可能參與了NS蛋白尿的發(fā)生。而糖皮質激素正是基于這一假說治療NS,糖皮質激素可以通過與糖皮質激素受體(GR)結合形成GC-GR復合物,與負糖皮質激素元件結合,從而抑制轉錄因子與該基因結合,從而達到抑制IL-2、IL-8、TNF-α等的表達,達到治療目的。 但是隨著對腎小球超微結構的認識,人們發(fā)現(xiàn)在MCNS'腎活檢組織標本以及嘌呤霉素氨基核苷(PAN)誘導的NS模型中,光鏡和電鏡下腎組織中均未見有炎癥細胞的浸潤、免疫復合物沉積等,僅存在腎小球臟層上皮細胞即足細胞足突的融合和裂孔隔膜的消失,提示足細胞變化包括形態(tài)和功能的變化在蛋白尿產生中起了更直接的作用。而足突融合程度與蛋白尿呈正相關,這種變化與足突的細胞骨架肌絲重排和分布異常有關,其中足細胞相關分子也發(fā)生了變化,對足細胞裂孔隔膜相關分子(nephrin、podocin、CD2AP)及細胞骨架分子α-actinin-4的進一步研究發(fā)現(xiàn)這些分子基因的突變和表達異常與先天性腎病及FSGS相關,是維系足細胞正常形態(tài)功能所必須的；裂孔隔膜不僅是足細胞信號轉導的平臺,也是足細胞與骨架蛋白actin目互作用的平臺,以上證據(jù)強烈提示,NS最根本是足細胞的病變。而近期的研究發(fā)現(xiàn)足細胞上存在糖皮質激素受體,糖皮質激素可以通過受體和非受體途徑,改善足細胞的損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)地塞米松具有直接減少足細胞凋亡的能力,還可以通過穩(wěn)定足細胞細胞骨架,減少細胞骨架的重排,改善足細胞的黏附性從而達到減少蛋白尿的目的。 在MCNS發(fā)生發(fā)展過程中,存在多種蛋白分子的參與。本課題組前期應用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)：MCNS患兒的血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein3,ANGPTL3) mRNA的表達水平顯著高于正常兒童；應用激光微切割技術分離腎組織發(fā)現(xiàn)在阿霉素大鼠腎病模型的腎小球內ANGPTL3mRNA和蛋白的表達隨著蛋白尿的加重而表達增高；進一步運用Western免疫印跡和實時熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的足細胞正常表達ANGPTL3比較低,但在PAN誘導足細胞損傷模型中發(fā)現(xiàn),損傷24小時后ANGPTL3mRNA和蛋白的表達均明顯高于正常對照組；以上結果均提示／ANGPTL3可能參與了MCNS相關的蛋白尿。 地塞米松對足細胞損傷的保護作用分子機制如何?是否與足細胞相關熱點分子有關?而ANGPTL3是否參與了足細胞損傷過程及可能的分子機制,目前國內外尚無這方面的研究和報道。 本研究以體外培養(yǎng)的小鼠足細胞株(MPC5)為研究對象,給予或不給予地塞米松1μM預處理,再給予PAN50μg/ml處理24小時,首先以細胞免疫熒光法和激光共聚焦顯微鏡觀察足細胞形態(tài)和通透性改變。結果顯示,與對照組比較,PAN誘導損傷組F-actin紊亂不均勻,部分熒光強度增強,胞膜間連接呈不連續(xù),胞漿內熒光強度變暗,應力纖維幾乎消失；地塞米松預處理之后PAN所致的F-actin排列紊亂改善,F-actin分布重新趨于正常狀態(tài),熒光強度增強。進一步熒光強度值比較發(fā)現(xiàn)PAN損傷組明顯低于對照組(282.6±74.65vs1209.0±403.39),而地塞米松預處理之后再給予PAN損傷組熒光強度值與PAN損傷組相比明顯增強(1030.0±101.24vs282.6+74.65)；利用兩室彌散系統(tǒng)進一步通過檢測外源性標記FITC-牛血清白蛋白(BSA)的濾過量,來評價足細胞通透性的變化,結果顯示：與對照組相比,PAN損傷組FITC-BSA的濾過率明顯增加為40.7%±7.6%；而給予地塞米松預處理后再給予PAN損傷,FITC-BSA的濾過率較前明顯降低(6.8%±2.6%)。 進一步探討地塞米松對PAN所致足細胞損傷保護作用是否與足細胞相關熱點分子相關,本實驗結果顯示,地塞米松可以以使正常足細胞相關分子nephrin mRNA和蛋白水平表達均增高,而podocin和α-actinin-4mRNA表達無明顯變化；PAN損傷組足細胞相關分子nephrin、podocin和α-actinin-4mRNA水平的表達均增高,而地塞米松預處理組可以抑制這種表達增高；進一步蛋白水平的比較發(fā)現(xiàn),PAN損傷組與對照組相比podocin蛋白變化不明顯,但地塞米松在保護足細胞損傷的同時可以導致podocin、nephrin與α-actinin-4蛋白的表達下降。提示地塞米松保護PAN損傷同時伴有足細胞相關熱點分子的改變。 我們同時觀察了地塞米松是否影響ANGPTL3的表達,結果發(fā)現(xiàn)PAN損傷組ANGPTL3mRNA和蛋白表達均增高,而地塞米松可以抑制ANGPTL3的異常表達；進一步實驗結果顯示地塞米松對正常足細胞ANGPTL3的表達無影響。采用瞬時轉染方法高表達和低表達ANGPTL3,觀察細胞骨架F-actin和足細胞通透性的變化,結果發(fā)現(xiàn)高表達ANGPTL3組足細胞F-actin的分布和熒光強度出現(xiàn)了類似PAN所致的損傷,足細胞單層膜通透性增加,FITC-BSA的濾過率增加,而低表達ANGPTL3組足細胞F-actin的分布和熒光強度與空質粒轉染組無明顯差異,單層膜足細胞通透性無明顯變化；提示高表達ANGPTL3可以引起足細胞損傷,而地塞米松可以保護ANGPTL3所致足細胞損傷。 進一步觀察ANGPTL3與nephrin、podocin和α-actinin-4之間是否存在密切聯(lián)系,結果顯示ANGPTL3高表達使nephrin和α-actinin-4mRNA和蛋白表達均增高,但對podocin mRNA表達無影響；而ANGPTL3低表達對足細胞相關分子的表達無明顯影響；提示ANGPTL3引起足細胞損傷過程中可能有nephrin和α-actinin-4參與作用。給予地塞米松處理ANGPTL3高表達組后,觀察到足細胞損傷減輕的同時,nephrin和podocin mRNA水平和蛋白水平的表達均降低,但不能改變α-actinin-4的表達。 綜上所述,本課題通過地塞米松對足細胞損傷保護作用的分子機制研究發(fā)現(xiàn)PAN所致足細胞損傷過程中,ANGPTL3表達顯著增高,地塞米松不僅可以保護PAN所致足細胞損傷,同時抑制ANGPTL3的高表達。地塞米松在保護PAN所致足細胞損傷和質粒瞬時轉染所致ANGGPTL3高表達所引起的足細胞損傷中,一定程度上可能與目前足細胞相關的熱點分子有關。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

小時達到高峰，48-72小時達到平臺，仍高于對照組，P<0.05 (圖1-4)2.檢測給予不同干預ANGPTL3蛋白表達：PAN組ANGPTL3蛋白表達高于對照組，而給予地塞米松預處理之后的Dex+PAN組ANGPTL3蛋白水平明顯下降，P<0.05 (圖 1-5)。表1-1不同時間點及不同干預組ANGPTL3mRNA的表達PAN不同干預組 ANGPTL3/p-actin cDNA相對拷貝數(shù)Con 4.78E-03±5.85E-03P12h 2.06 E-01±1.25E-02P24h (PAN) 6.21E-01±1.08E-01P36h 6.01 E-01 士 1.36E-01P48h 3.38E-01±1.52E-01P72h 3.21E-01±1.68E-01Dex+PAN 1.74E-02±1.33E-02

架的作用過程，目前仍不清楚。本部分研究目的是通過質粒瞬時轉染高表表達ANGPTL3觀察其對細胞骨架和通透性的影響，探討地塞米NGPTL3的關系，進一步探討地塞米松治療NS的可能分子機制。材料與方法、 材料ANGPTL3高表達質�；蜣D染主要試劑：粒PCDNA3.1-ANGPTL3由復旦大學附屬悅達生物技術公司合成，質粒圖圖；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibico公司；無血清培養(yǎng)Opti-MEM自InvitrogenIAGEN?OneStep RT-PCR Kit, QIAGEN?plasmid Midi Kid購自 QIAGEN公華-SofastTM轉染試劑盒購自廈門太陽馬生物工程公司；限制性內切酶購Kpn I購自日本TaKaRa公司；DNA Ladder Mark購自北京天為時代公司；D腸桿菌由病理教研室提供。EcoR I

Threshold: 33%圖2-2 Real-time PCR ANGPTL3產物曲線、CT值和溶解曲線四、ANGPTL3和地塞米松對足細胞細胞骨架蛋白F-actin的影響1.與空質粒轉染組比較，ANGPTL3高表達組F-actin紊亂不均勻，出現(xiàn)類似PAN損傷的變化，部分焚光強度增強，胞膜間連接呈不連續(xù)，胞楽內熒光強度變暗，應力纖維幾乎消失；而給予地塞米松預處理之后ANGPTL3高表達所致的F-actin排列紊亂改善，F(xiàn)-actin分布重新趨于正常狀態(tài)，突光強度增強；而ANGPTL3低表達組F-actin排列和表達與對照組相比無明顯變化（圖2-3)；2. F-actin突光強度值比較發(fā)現(xiàn)ANGPTL3高表達組明顯低于空質粒轉染組(398.4+66.2 vs 1082.0±78.9)，而Dex+ANGPTL3高表達組突光強度值與ANGPTL3高表達組相比明顯增強（1034.6±246.5 vs398.4±66.2 )，P<0.05,ANGPTL3低表達組（1009.0±353.4)與空質粒轉染組相比焚光強度值無明顯差異，
【參考文獻】

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1 陳朝紅;劉志紅;孫驊;姚根宏;秦衛(wèi)松;黎磊石;;雷公藤甲素干預足細胞病變的體外觀察[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2007年02期

2 李曉忠,袁海濤,張學光;Adriamycin increases podocyte permeability: evidence and molecular mechanism[J];Chinese Medical Journal;2003年12期

3 管娜,丁潔,張敬京,楊霽云;嘌呤霉素腎病大鼠腎小球中nephrin、podocin和α-actinin與蛋白尿的關系[J];中華腎臟病雜志;2004年01期

4 武建文,徐虹,吳瀅,朱列偉,陳蓮;阿霉素腎病大鼠腎組織中血管形成素樣蛋白3表達與蛋白尿及高脂血癥的關系[J];中華腎臟病雜志;2005年04期

5 武建文;徐虹;趙曉晴;周曉燕;吳瀅;;阿霉素腎病大鼠腎組織中血管生成素樣蛋白3基因表達[J];中華腎臟病雜志;2006年01期

6 邢燕;丁潔;范青鋒;管娜;張敬京;;三種不同藥物作用下足細胞分子的變化[J];中華腎臟病雜志;2006年05期

7 饒佳;徐虹;孫利;趙仲華;張秀榮;;兒童原發(fā)性腎病綜合征中血管生成素樣蛋白3的表達[J];中華腎臟病雜志;2006年05期

本文編號：2883745