發(fā)布時間：2020-11-14 17:25

　　 原發(fā)性腎病綜合征(NS)是小兒常見的腎小球疾病,其中以微小病變(MCD)為主要病理類型,約占75%-90%,臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿,低蛋白血癥,水腫,高血脂,大部分患兒對糖皮質(zhì)激素治療敏感,盡管在人類和動物模型中進(jìn)行了廣泛研究,圍繞NS發(fā)病機(jī)制和蛋白尿形成機(jī)制以及糖皮質(zhì)激素的治療機(jī)制仍不十分清楚。 自上世紀(jì)50年代以來,糖皮質(zhì)激素開始用于治療兒童腎病綜合征,約90%的NS患兒對激素治療敏感,NS相關(guān)的死亡率由治療前的35%下降到3%,口服糖皮質(zhì)激素開始成為治療兒童NS的一線用藥；臨床上雖然已經(jīng)進(jìn)行了大量的臨床試驗和meta分析,探討針對兒童合適的治療策略,以期更合理的應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的治療作用減少其相應(yīng)的副作用,但是仍有約60%腎病綜合征患兒存在頻復(fù)發(fā),需要長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素,而長期激素治療可以誘發(fā)和加重感染,感染又可致疾病反復(fù)和死亡率增加,同時可以引起生長遲緩,免疫抑制,高血壓,抑制傷口修復(fù),骨質(zhì)疏松以及代謝紊亂等激素相關(guān)的副作用,給患兒及家長造成了很大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此明確蛋白尿的發(fā)生機(jī)制及糖皮質(zhì)激素的治療作用機(jī)制仍是對兒童腎臟病工作者的挑戰(zhàn)。 1974年Shalhoub提出“可溶性介質(zhì)假說”(soluble mediator hypothesis),指出微小病變腎病綜合征(MCNS)主要是由于免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致相關(guān)的細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)分泌異常所致。圍繞這一假說,在人與NS模型中展開了很多研究,發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-a)等在NS患兒中表達(dá)增高,但在疾病緩解期則與正常組無差異；進(jìn)一步動物實驗發(fā)現(xiàn),IL-8、TNF-α可以導(dǎo)致實驗動物產(chǎn)生蛋白尿；提示這些細(xì)胞因子可能參與了NS蛋白尿的發(fā)生。而糖皮質(zhì)激素正是基于這一假說治療NS,糖皮質(zhì)激素可以通過與糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合形成GC-GR復(fù)合物,與負(fù)糖皮質(zhì)激素元件結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄因子與該基因結(jié)合,從而達(dá)到抑制IL-2、IL-8、TNF-α等的表達(dá),達(dá)到治療目的。 但是隨著對腎小球超微結(jié)構(gòu)的認(rèn)識,人們發(fā)現(xiàn)在MCNS'腎活檢組織標(biāo)本以及嘌呤霉素氨基核苷(PAN)誘導(dǎo)的NS模型中,光鏡和電鏡下腎組織中均未見有炎癥細(xì)胞的浸潤、免疫復(fù)合物沉積等,僅存在腎小球臟層上皮細(xì)胞即足細(xì)胞足突的融合和裂孔隔膜的消失,提示足細(xì)胞變化包括形態(tài)和功能的變化在蛋白尿產(chǎn)生中起了更直接的作用。而足突融合程度與蛋白尿呈正相關(guān),這種變化與足突的細(xì)胞骨架肌絲重排和分布異常有關(guān),其中足細(xì)胞相關(guān)分子也發(fā)生了變化,對足細(xì)胞裂孔隔膜相關(guān)分子(nephrin、podocin、CD2AP)及細(xì)胞骨架分子α-actinin-4的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些分子基因的突變和表達(dá)異常與先天性腎病及FSGS相關(guān),是維系足細(xì)胞正常形態(tài)功能所必須的；裂孔隔膜不僅是足細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺,也是足細(xì)胞與骨架蛋白actin目互作用的平臺,以上證據(jù)強(qiáng)烈提示,NS最根本是足細(xì)胞的病變。而近期的研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞上存在糖皮質(zhì)激素受體,糖皮質(zhì)激素可以通過受體和非受體途徑,改善足細(xì)胞的損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)地塞米松具有直接減少足細(xì)胞凋亡的能力,還可以通過穩(wěn)定足細(xì)胞細(xì)胞骨架,減少細(xì)胞骨架的重排,改善足細(xì)胞的黏附性從而達(dá)到減少蛋白尿的目的。 在MCNS發(fā)生發(fā)展過程中,存在多種蛋白分子的參與。本課題組前期應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)：MCNS患兒的血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein3,ANGPTL3) mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常兒童；應(yīng)用激光微切割技術(shù)分離腎組織發(fā)現(xiàn)在阿霉素大鼠腎病模型的腎小球內(nèi)ANGPTL3mRNA和蛋白的表達(dá)隨著蛋白尿的加重而表達(dá)增高；進(jìn)一步運(yùn)用Western免疫印跡和實時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞正常表達(dá)ANGPTL3比較低,但在PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型中發(fā)現(xiàn),損傷24小時后ANGPTL3mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯高于正常對照組；以上結(jié)果均提示／ANGPTL3可能參與了MCNS相關(guān)的蛋白尿。 地塞米松對足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用分子機(jī)制如何?是否與足細(xì)胞相關(guān)熱點分子有關(guān)?而ANGPTL3是否參與了足細(xì)胞損傷過程及可能的分子機(jī)制,目前國內(nèi)外尚無這方面的研究和報道。 本研究以體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞株(MPC5)為研究對象,給予或不給予地塞米松1μM預(yù)處理,再給予PAN50μg/ml處理24小時,首先以細(xì)胞免疫熒光法和激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)和通透性改變。結(jié)果顯示,與對照組比較,PAN誘導(dǎo)損傷組F-actin紊亂不均勻,部分熒光強(qiáng)度增強(qiáng),胞膜間連接呈不連續(xù),胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度變暗,應(yīng)力纖維幾乎消失；地塞米松預(yù)處理之后PAN所致的F-actin排列紊亂改善,F-actin分布重新趨于正常狀態(tài),熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。進(jìn)一步熒光強(qiáng)度值比較發(fā)現(xiàn)PAN損傷組明顯低于對照組(282.6±74.65vs1209.0±403.39),而地塞米松預(yù)處理之后再給予PAN損傷組熒光強(qiáng)度值與PAN損傷組相比明顯增強(qiáng)(1030.0±101.24vs282.6+74.65)；利用兩室彌散系統(tǒng)進(jìn)一步通過檢測外源性標(biāo)記FITC-牛血清白蛋白(BSA)的濾過量,來評價足細(xì)胞通透性的變化,結(jié)果顯示：與對照組相比,PAN損傷組FITC-BSA的濾過率明顯增加為40.7%±7.6%；而給予地塞米松預(yù)處理后再給予PAN損傷,FITC-BSA的濾過率較前明顯降低(6.8%±2.6%)。 進(jìn)一步探討地塞米松對PAN所致足細(xì)胞損傷保護(hù)作用是否與足細(xì)胞相關(guān)熱點分子相關(guān),本實驗結(jié)果顯示,地塞米松可以以使正常足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin mRNA和蛋白水平表達(dá)均增高,而podocin和α-actinin-4mRNA表達(dá)無明顯變化；PAN損傷組足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin、podocin和α-actinin-4mRNA水平的表達(dá)均增高,而地塞米松預(yù)處理組可以抑制這種表達(dá)增高；進(jìn)一步蛋白水平的比較發(fā)現(xiàn),PAN損傷組與對照組相比podocin蛋白變化不明顯,但地塞米松在保護(hù)足細(xì)胞損傷的同時可以導(dǎo)致podocin、nephrin與α-actinin-4蛋白的表達(dá)下降。提示地塞米松保護(hù)PAN損傷同時伴有足細(xì)胞相關(guān)熱點分子的改變。 我們同時觀察了地塞米松是否影響ANGPTL3的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAN損傷組ANGPTL3mRNA和蛋白表達(dá)均增高,而地塞米松可以抑制ANGPTL3的異常表達(dá)；進(jìn)一步實驗結(jié)果顯示地塞米松對正常足細(xì)胞ANGPTL3的表達(dá)無影響。采用瞬時轉(zhuǎn)染方法高表達(dá)和低表達(dá)ANGPTL3,觀察細(xì)胞骨架F-actin和足細(xì)胞通透性的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ANGPTL3組足細(xì)胞F-actin的分布和熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了類似PAN所致的損傷,足細(xì)胞單層膜通透性增加,FITC-BSA的濾過率增加,而低表達(dá)ANGPTL3組足細(xì)胞F-actin的分布和熒光強(qiáng)度與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無明顯差異,單層膜足細(xì)胞通透性無明顯變化；提示高表達(dá)ANGPTL3可以引起足細(xì)胞損傷,而地塞米松可以保護(hù)ANGPTL3所致足細(xì)胞損傷。 進(jìn)一步觀察ANGPTL3與nephrin、podocin和α-actinin-4之間是否存在密切聯(lián)系,結(jié)果顯示ANGPTL3高表達(dá)使nephrin和α-actinin-4mRNA和蛋白表達(dá)均增高,但對podocin mRNA表達(dá)無影響；而ANGPTL3低表達(dá)對足細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)無明顯影響；提示ANGPTL3引起足細(xì)胞損傷過程中可能有nephrin和α-actinin-4參與作用。給予地塞米松處理ANGPTL3高表達(dá)組后,觀察到足細(xì)胞損傷減輕的同時,nephrin和podocin mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均降低,但不能改變α-actinin-4的表達(dá)。 綜上所述,本課題通過地塞米松對足細(xì)胞損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)PAN所致足細(xì)胞損傷過程中,ANGPTL3表達(dá)顯著增高,地塞米松不僅可以保護(hù)PAN所致足細(xì)胞損傷,同時抑制ANGPTL3的高表達(dá)。地塞米松在保護(hù)PAN所致足細(xì)胞損傷和質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染所致ANGGPTL3高表達(dá)所引起的足細(xì)胞損傷中,一定程度上可能與目前足細(xì)胞相關(guān)的熱點分子有關(guān)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R726.9
【部分圖文】：

小時達(dá)到高峰，48-72小時達(dá)到平臺，仍高于對照組，P<0.05 (圖1-4)2.檢測給予不同干預(yù)ANGPTL3蛋白表達(dá)：PAN組ANGPTL3蛋白表達(dá)高于對照組，而給予地塞米松預(yù)處理之后的Dex+PAN組ANGPTL3蛋白水平明顯下降，P<0.05 (圖 1-5)。表1-1不同時間點及不同干預(yù)組ANGPTL3mRNA的表達(dá)PAN不同干預(yù)組 ANGPTL3/p-actin cDNA相對拷貝數(shù)Con 4.78E-03±5.85E-03P12h 2.06 E-01±1.25E-02P24h (PAN) 6.21E-01±1.08E-01P36h 6.01 E-01 士 1.36E-01P48h 3.38E-01±1.52E-01P72h 3.21E-01±1.68E-01Dex+PAN 1.74E-02±1.33E-02

架的作用過程，目前仍不清楚。本部分研究目的是通過質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染高表表達(dá)ANGPTL3觀察其對細(xì)胞骨架和通透性的影響，探討地塞米NGPTL3的關(guān)系，進(jìn)一步探討地塞米松治療NS的可能分子機(jī)制。材料與方法、 材料ANGPTL3高表達(dá)質(zhì)�；蜣D(zhuǎn)染主要試劑：粒PCDNA3.1-ANGPTL3由復(fù)旦大學(xué)附屬悅達(dá)生物技術(shù)公司合成，質(zhì)粒圖圖；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibico公司；無血清培養(yǎng)Opti-MEM自InvitrogenIAGEN?OneStep RT-PCR Kit, QIAGEN?plasmid Midi Kid購自 QIAGEN公華-SofastTM轉(zhuǎn)染試劑盒購自廈門太陽馬生物工程公司；限制性內(nèi)切酶購Kpn I購自日本TaKaRa公司；DNA Ladder Mark購自北京天為時代公司；D腸桿菌由病理教研室提供。EcoR I

Threshold: 33%圖2-2 Real-time PCR ANGPTL3產(chǎn)物曲線、CT值和溶解曲線四、ANGPTL3和地塞米松對足細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白F-actin的影響1.與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，ANGPTL3高表達(dá)組F-actin紊亂不均勻，出現(xiàn)類似PAN損傷的變化，部分焚光強(qiáng)度增強(qiáng)，胞膜間連接呈不連續(xù)，胞楽內(nèi)熒光強(qiáng)度變暗，應(yīng)力纖維幾乎消失；而給予地塞米松預(yù)處理之后ANGPTL3高表達(dá)所致的F-actin排列紊亂改善，F(xiàn)-actin分布重新趨于正常狀態(tài)，突光強(qiáng)度增強(qiáng)；而ANGPTL3低表達(dá)組F-actin排列和表達(dá)與對照組相比無明顯變化（圖2-3)；2. F-actin突光強(qiáng)度值比較發(fā)現(xiàn)ANGPTL3高表達(dá)組明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(398.4+66.2 vs 1082.0±78.9)，而Dex+ANGPTL3高表達(dá)組突光強(qiáng)度值與ANGPTL3高表達(dá)組相比明顯增強(qiáng)（1034.6±246.5 vs398.4±66.2 )，P<0.05,ANGPTL3低表達(dá)組（1009.0±353.4)與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比焚光強(qiáng)度值無明顯差異，
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2883745