研究背景 胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)包括胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)和新生兒低出生體重(low birth weight,LBW)。我國低出生體重兒(low birth weightinfant,LBWI)的出生率約為4.75%～8.5%,LBW是圍產(chǎn)期嬰兒發(fā)病和死亡的主要危險因素之一。聯(lián)合國1995年的報告估計,發(fā)生心血管疾病和中風(fēng)的成年患者至少10%為LBWI,大約50%的高血壓患者為LBWI。自1992年Barker首次發(fā)現(xiàn)心血管疾病與出生體重有關(guān),進而提出“胚胎編程”假說以來,越來越多的流行病學(xué)和臨床研究發(fā)現(xiàn),LBW是心血管不良事件相對獨立的危險因素之一,同時對成人期的腎臟和高血壓產(chǎn)生不同程度的影響�，F(xiàn)已有80項有關(guān)研究(其中涉及44.4萬個病例,年齡跨度0～80歲,包括多種種族人群)證實了LBW與高血壓的相關(guān)性。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),LBW導(dǎo)致腎單位數(shù)目的減少,同時腎單位的減少是成人期發(fā)展為全身性高血壓的一個獨立的危險因素。LBW對腎臟發(fā)育和高血壓的影響,引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。研究LBW引起成年后發(fā)生代謝綜合征的機制,以及實施成年期疾病的早期防治已經(jīng)成為一個研究熱點。 人類流行病學(xué)研究和動物實驗均證實LBW與腎單位數(shù)目減少有明顯相關(guān)性,但是其發(fā)生機制尚不清楚。腎臟的發(fā)育過程包括快速的結(jié)構(gòu)重建,尤其是后腎階段,這個過程需要大量的細胞增殖和凋亡,并且受到多種相關(guān)基因的嚴格調(diào)控及互相作用,如Wt1、Bcl-2、Pax2等。同時,研究表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)不僅是維持腎臟正常發(fā)育的關(guān)鍵系統(tǒng),而且是機體調(diào)控內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一。而血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中的主要活性肽,首先作為一種血管活性物質(zhì),可優(yōu)先收縮腎小球出球小動脈,引起腎小球內(nèi)高濾過損傷,亦可收縮系膜細胞,引起腎小球超濾系數(shù)下降。更為重要的是,近年來一致認為AngⅡ不僅是血管活性物質(zhì),更是一種促腎生長因子,除了可直接促使腎小球系膜細胞增生和肥大外,還能刺激其他血管活性物質(zhì)和細胞因子產(chǎn)生,導(dǎo)致細胞外基質(zhì)進行性積聚,促進炎癥細胞浸潤。AngⅡ通過組織局部的特異性受體發(fā)揮作用,如AngⅡ2型受體(AT2R)。研究發(fā)現(xiàn)AT2R在胎兒和圍生期嬰兒體內(nèi)表達水平較高,表明它在細胞分化和器官發(fā)育過程中有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),AT2R的激活則對抗平滑肌細胞增殖,促進細胞凋亡。因此本實驗擬觀察LBW是否通過影響RAS,調(diào)節(jié)腎臟發(fā)生中關(guān)鍵基因的表達以及細胞的增殖和凋亡,從而引起腎單位數(shù)目減少的發(fā)生。 營養(yǎng)素是基因表達的重要調(diào)節(jié)因子,它可以通過控制代謝產(chǎn)物或代謝狀態(tài)導(dǎo)致信使RNA、蛋白質(zhì)合成與功能改變�！盃I養(yǎng)程序化”的理論指出發(fā)育關(guān)鍵時期的營養(yǎng)狀況可以對機體臟器的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生長期乃至終身的影響。早期營養(yǎng)環(huán)境刺激機體產(chǎn)生適應(yīng)性的克隆選擇或者分化母細胞的增殖,可以使組織細胞數(shù)量或比例永久性地得到改變。理論上在生命早期給予營養(yǎng)干預(yù)、改變機體營養(yǎng)環(huán)境,可以改善臟器的結(jié)構(gòu)和功能,有助于對疾病的早期預(yù)防。因此,補充營養(yǎng)素來改變發(fā)育關(guān)鍵時期LBW人群或動物的營養(yǎng)狀況,從而改變腎臟發(fā)育基因、信號傳導(dǎo)通路,以及最終改變腎臟的結(jié)構(gòu)和功能,達到減輕腎臟的病理損害、減輕高血壓癥狀甚至減少高血壓等發(fā)生的目的。所以選擇一種合適的營養(yǎng)素干預(yù)是十分必要的。精氨酸是一種條件必需氨基酸,由于人體合成量較少,在嬰幼兒的生長和發(fā)育時期是一種重要氨基酸,其在生物體內(nèi)起生理作用的是左旋精氨酸(L-Arg),發(fā)揮著廣泛而重要的生理和藥理作用:促進FGR胎兒生長發(fā)育、減少AngⅡ含量、降低血壓、改善腎功能等等。給LBW個體補充L-Arg,是否可以通過減少腎臟細胞凋亡、生成NO增多、減少AngⅡ生成等作用,來改善腎臟的結(jié)構(gòu)和功能、減輕或杜絕高血壓的發(fā)生,達到成年期疾病早期防治的目的?解決這一問題,將為L-Arg治療LBWI提供有力的理論依據(jù)。本實驗分為以下三部分: 第一部分LBW對大鼠腎臟發(fā)育和血壓的影響 目的:用孕期全程低蛋白(10%蛋白)飲食法制造LBW仔鼠模型,觀察LBW對仔鼠腎臟發(fā)育和血壓的影響,并且探討LBW是否是腎功能減低和高血壓發(fā)生的危險因素之一。 方法:選擇健康三月齡SD健康大鼠,按照雌雄1:1的比例置于同一籠中交配。受孕成功的孕鼠隨機分為正常組和LBW組。正常組母鼠自受孕后第1d開始給予21%正常蛋白飲食,而LBW組母鼠自受孕后第1d開始給予10%蛋白飲食,建立LBW仔鼠模型。兩組仔鼠出生后至3m齡,均給予母鼠及仔鼠21%正常蛋白飼料喂養(yǎng)、自由飲水。選擇7d、21d、2m和3m時作為觀察的4個時間點,用尾套法測量2m和3m時大鼠血壓;留取7d、21d、2m和3m血標本和21d、2m和3m尿標本,檢測腎功能各指標和24h尿蛋白量;2m時用酸消化法計算腎小球數(shù)目。 結(jié)果:1、LBW組仔鼠平均出生體重為(6.09±0.50)g,正常組為(6.98±0.44)g。LBW組仔鼠平均出生體重明顯低于正常組(P＜0.01)。LBW組仔鼠呈現(xiàn)出階段性追趕生長:7d時與正常組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),LBW組體重顯著降低;此后出現(xiàn)追趕生長,到21d時,兩組體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;至2m時,LBW組大鼠體重生長再次落后,與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);到3m時兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,LBW組達到追趕生長。 2、2m時,利用酸消化法檢測兩組仔鼠單側(cè)腎臟總的腎小球數(shù)目。LBW組仔鼠腎小球數(shù)目明顯低于正常組(22720±639)個/單側(cè)vs.(28520±526)個/側(cè),P＜0.01。 3、2m時,LBW組和正常組大鼠的血壓分別為(120.03±8.31)mmHg和(96.28±5.82)mmHg,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);至3m時,兩組仔鼠的血壓均有增高,分別為(127.03±7.13)mmHg和(109.75±9.26)mmHg,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4、從21d～3m,LBW組大鼠Ccr與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,LBW組顯著降低;3m時LBW組24h尿蛋白量與正常組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(117.17±10.40)mg/(kg·d)vs.(79.28±14.26)mg/(kg·d),P＜0.01,LBW組顯著增加。 5、相關(guān)性分析顯示:2m時,大鼠血壓和腎小球數(shù)目有顯著負相關(guān)性(r_1=-0.919,P_1=0.008);腎臟重量和血壓有顯著負相關(guān)性(r_2=-0.680,P_2=0.030);Ccr與腎臟重量成顯著正相關(guān)(r_3=0.642,P_3=0.024);Ccr與腎小球數(shù)目成顯著正相關(guān)(r_4=0.619,P_4=0.032)。 6、兩組大鼠腎小球體積在7d時比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(μm~3×10~5)(正常組:0.41±0.05 vs.LBW組:0.50±0.08);在3m時,LBW組比正常組顯著增大(μm~3×10~5)(1.19±0.09 vs.0.95±0.13,P＜0.01)。 結(jié)論:1、孕期用低蛋白飲食法成功建立了LBW大鼠模型,制�？煽�,效果比較理想。 2、孕鼠低蛋白飲食可致LBW仔鼠成年期血壓增高。 3、LBW大鼠腎臟發(fā)育延遲,并且腎單位數(shù)目減少了約20.34%。 4、LBW大鼠血壓和腎單位數(shù)目有顯著負相關(guān),腎單位數(shù)目減少可能是LBW大鼠發(fā)生高血壓的重要原因之一。 5、LBW大鼠腎功能減退可能參與了LBW大鼠高血壓的發(fā)生。 第二部分LBW大鼠發(fā)生腎單位減少和高血壓的機制研究 目的:研究LBW大鼠發(fā)育過程中,1、腎臟細胞的增生和凋亡及相關(guān)調(diào)控基因的表達;2、血管緊張素Ⅱ、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)及NO濃度的變化;3、Pax2基因的表達變化,探討LBW大鼠發(fā)生腎臟功能減低和高血壓的機制。 方法:選取LBW大鼠為研究對象,采用TUNEL法和Ki-67免疫組化法檢測腎組織細胞的增殖和凋亡;RT-PCR法測定AT2R、Wt1和Bcl-2mRNA表達水平;用Western blot和免疫組化法分別檢測腎組織中基因Pax2的表達。 結(jié)果:1、7d時與正常組比較,LBW組腎臟細胞凋亡指數(shù)明顯增高(19.27±1.05%vs.13.24±0.89%,P＜0.05)。LBW組腎臟組織WT1mRNA表達在7d時顯著減低,與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.83±0.11 vs.0.97±0.10,P＜0.05);LBW組腎臟組織Bcl-2 mRNA在7d時也明顯降低,與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.88±0.06 vs.1.08±0.10,P＜0.05)。 2、2m和3m時,LBW組與正常組血漿AngⅡ濃度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),LBW組明顯高于正常組。2m時LBW組大鼠腎臟組織AT2R mRNA表達顯著增高,與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1.085±0.040 vs.0.963±0.051,P＜0.01)。在7d和21d,兩組均未見Pax2的明顯表達;到2m時LBW大鼠在腎小球和腎小管區(qū)可見Pax2陽性細胞的表達和蛋白的表達,3m時LBW大鼠腎臟Pax2陽性細胞和蛋白的表達均比2m更顯著;而正常組僅見輕微蛋白表達。 3、LBW大鼠血清NO濃度在21d達到峰值,但在四個觀察時間點均較正常組顯著減低;在2m和3m時,LBW組大鼠血漿cGMP濃度顯著降低。 4、相關(guān)性分析顯示:2m時,AngⅡ濃度與血壓成顯著正相關(guān)(r=0.636,P=0.048)。 結(jié)論:1、腎發(fā)生中細胞凋亡的增加,以及Wt1、Bcl-2抗凋亡基因的表達降低可能是LBW大鼠腎單位數(shù)目減少的機制之一。 2、AngⅡ→AT2R通路可能是LBW大鼠腎臟功能減低和高血壓發(fā)生的機制之一�；騊ax2的再表達可能參與了LBW大鼠腎臟功能減低和高血壓的發(fā)生。 3、血cGMP和NO濃度的降低可能參與了LBW大鼠高血壓發(fā)生的機制。 第三部分左旋精氨酸干預(yù)對LBW大鼠腎臟和血壓的影響 目的:用左旋精氨酸(L-Arg)干預(yù)后,觀察大鼠腎臟的結(jié)構(gòu)和功能以及血壓的變化情況,探討L-Arg對LBW大鼠血壓及腎臟影響的機制。 方法:L-Arg干預(yù)組(簡稱LT組)母鼠自受孕后第1天到仔鼠出生止給予10%低蛋白飲食;在仔鼠出生至21d哺乳期內(nèi),給予母鼠和仔鼠21%正常蛋白飼料喂養(yǎng),另外加L-Arg水干預(yù),按L-Arg 200mg/(kg.d)加入50ml飲水中白天給予,夜間自由飲水。正常組和LBW組造模及喂養(yǎng)方法同第一部分。于7d、21d、2m和3m時,用化學(xué)法測血清中NO濃度;放射免疫法測血漿中血管緊張素(AngⅡ)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)濃度;尾套法測2m和3m時大鼠血壓;常規(guī)生化法檢測腎功能各指標和24h尿蛋白量;RT-PCR法檢測腎組織Desmin mRNA表達;WesternBlot法測大鼠Pax2基因蛋白的表達;電鏡觀察腎小球系膜細胞和足細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果:1.用L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠體重增長較LBW多,21d時甚至超過正常組。 2.用L-Arg干預(yù)后,21d,2m和3m時LT組大鼠血清NO濃度均比LBW組顯著升高。 3.用L-Arg干預(yù)后,2m時LT組血漿AngⅡ濃度比LBW組顯著降低。2m和3m時,LT組cGMP濃度比LBW組顯著增加,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 4.用L-Arg干預(yù)后,2m時與LBW組比較,LT組大鼠血壓顯著降低(P＜0.05)。 5.用L-Arg干預(yù)后,2m和3m時與LBW組比較,LT組Ccr顯著增加(P＜0.05);3m時LT組24h尿蛋白量比LBW組顯著降低(P＜0.01)。 6.用L-Arg干預(yù)后,21d時LT組Desmin mRNA表達與正常組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),LT組表達增高。2m時,LT組比LBW組顯著降低(P＜0.01),而與正常組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 7.用L-Arg干預(yù)后,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),到2月和3m時,與LBW組比較,LT組大鼠腎組織Pax2蛋白表達顯著減少(P＜0.01)。 8.用L-Arg干預(yù)后,電鏡發(fā)現(xiàn),2m時LBW組和LT組腎小球系膜細胞增生、濾過膜足突減少及部分溶合;LT組系膜細胞增生較LBW組減少;正常組系膜細胞無明顯增生,濾過膜足突形態(tài)正常。 結(jié)論:1.L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠體重增長較LBW多,2m時LT組血清NO水平和血漿cGMP濃度升高、AngⅡ濃度降低。 2.L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠2m時Ccr明顯增加,24h尿蛋白量3m齡時明顯減少。 3.L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠腎臟Desmin mRNA和Pax2表達減少。 4.L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠腎臟系膜細胞增生減少、超微結(jié)構(gòu)有一定改善。 綜上所述,本研究結(jié)論如下: 1、用低蛋白(10%蛋白)飲食法成功地建立了LBW大鼠模型,LBW大鼠腎單位數(shù)目減少、腎臟發(fā)育落后,出現(xiàn)了腎功能的減低和高血壓。提示:LBW可能是腎功能減退和高血壓的原因之一。 2、LBW大鼠的腎小球中細胞凋亡顯著增加,WT1和Bcl-2抗凋亡基因表達的下調(diào)。細胞凋亡增加可能是腎單位數(shù)目減少的機制之一。 3、LBW大鼠血漿AngⅡ濃度增加,AT2R mRNA表達的上調(diào),基因Pax2的再表達。AngⅡ→AT2R通路可能是LBW大鼠腎臟功能減低和高血壓發(fā)生的機制之一�；騊ax2的再表達可能參與了LBW大鼠腎臟功能減低和高血壓的發(fā)生。 4、血漿cGMP和血清NO濃度的降低可能參與了LBW大鼠發(fā)生高血壓的機制。 5、L-Arg干預(yù)后,LT組大鼠血NO和cGMP濃度升高、AngⅡ濃度一定程度降低,起一定程度降低血壓的作用;LT組大鼠Ccr增加和尿蛋白水平降低,L-Arg干預(yù)起一定程度改善腎功能作用;LT組大鼠腎臟Desmin mRNA和Pax2表達減少、腎臟系膜細胞增生減少,L-Arg干預(yù)使腎臟病理損害有一定修復(fù)作用。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R722
【部分圖文】：

︵切︶側(cè)聳州癮華田正常組LBW組圖1一2兩組大鼠出生體重比較柱形圖圖1一2顯示:LBW組仔鼠平均體重明顯低于正常組，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，‘只 0.05。 3.1.31uGR發(fā)生率以正常組仔鼠的平均出生體重減兩個標準差(即6.109)，作為界定IuGR的標準。低于6.109的低蛋白飼料LBw組仔鼠判定為IuGR仔鼠，進入實驗LBW組。正常組獲得IUGR仔鼠2只(剔出實驗)，LBW組獲得IUGR仔鼠30只。兩組IUGR發(fā)生率分別為3.08%和69.76%，LBW組IUGR發(fā)生率顯著高于正常組

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LBw組體重顯著降低;此后出現(xiàn)追趕生長，到21d時，兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;至2m時與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(代0.01)，LBW組大鼠體重生長落后;到3m時，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表1一4，圖1一3)。表1一4兩組仔鼠體重的比較(了士S，n=5，單位:g)組別 7d21dZm3m正常組L胖組16.18士1.09 11.25士4.23*32.24士5.8127.76士8.40174.30士9.13 119.26士25.66#224.5士10.61220.13士22.17注:與正常組比較，奮六0.01，’只0.05。正常組LBW組....︵的︶側(cè)聳時間點圖1一3兩組仔鼠不同時間點體重比較柱形圖從上柱形圖可見，2組大鼠體重均隨年齡增大而增重，LBW大鼠顯示出階段性追趕生長:7d時體重比正常組低，21d體重達到正常組標準;而后2m時體重增長落后
【引證文獻】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 董青藝;宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠高脂血癥的發(fā)生機制及共軛亞油酸營養(yǎng)調(diào)控[D];中南大學(xué);2012年

本文編號：2879789