發(fā)布時間：2020-11-03 00:34

　　 DiGeorge綜合征(DGS)是人類最常見的染色體缺失綜合征之一,活產(chǎn)嬰兒發(fā)病率約1/4000-5000。由于DGS累及組織器官較多,對患者的危害較大,特別是復(fù)雜心血管畸形,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。因此,研究DGS的發(fā)病機(jī)理,探索預(yù)防策略十分重要。 近年來研究表明,DGS的發(fā)生與tbxl基因單倍劑量不足(haploinsufficiency)、神經(jīng)嵴細(xì)胞(Neural crest cells, NCCs)發(fā)育異常等多種因素有關(guān)。鑒于此,我們研究了兩者之間的關(guān)系。NCCs中tbxl基因不表達(dá),可能存在介導(dǎo)tbxl基因作用的因子。 視黃酸(Retinoic acid, RA)是胚胎發(fā)育過程中必需的微量營養(yǎng)素,也是一種作用廣泛的信號分子,與心臟發(fā)育的多個階段有關(guān)。動物實驗證實,RA缺乏會造成心血管系統(tǒng)發(fā)育異常,與DGS特征相似。 為此,我們考慮RA是否為tbxl基因表達(dá)與NCCs發(fā)育之間的“橋梁”?我們以斑馬魚為模式生物,研究了tbxl基因表達(dá)對NCCs發(fā)育的影響,并探討RA在其中所起的作用。 為了模擬DGS患者tbxl基因單倍劑量不足,在第一部分,我們首先構(gòu)建了tbxl基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚模型。通過顯微注射特異性的tbxl基因反義寡核苷酸t(yī)bxl-MO,下調(diào)tbxl基因表達(dá),導(dǎo)致斑馬魚表型異常,表現(xiàn)為心臟環(huán)化障礙、心包水腫、下頜骨減小、耳囊減小、眼睛減小。通過tbxl-MO效率驗證,證實tbxl基因表達(dá)下調(diào)成功。 在tbxl基因表達(dá)下調(diào)的模型中,我們研究NCCs的發(fā)育過程。選取NCCs不同發(fā)育階段的標(biāo)記基因,通過胚胎整體原位雜交的方法,發(fā)現(xiàn)NCCs的起始、剝離、遷移、分化等多個發(fā)育環(huán)節(jié)都受到了tbxl基因表達(dá)下調(diào)的影響,發(fā)育過程受到抑制,心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞(Cardiac neural crest cells, CNCCs)向心臟細(xì)胞的分化障礙。 在第二部分,我們構(gòu)建了RA缺乏的斑馬魚模型。通過顯微注射視黃醛脫氫酶基因(raldh2)的反義寡核苷酸,下調(diào)raldh2基因表達(dá),并通過效率驗證,證實raldh2基因表達(dá)下調(diào)成功。Raldh2基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚,表型異常,表現(xiàn)為心臟環(huán)化障礙,心包水腫、體長短。而且我們發(fā)現(xiàn),NCCs的起始、剝離、遷移與分化過程也受到了抑制,CNCCs向心臟細(xì)胞分化障礙。 鑒于tbxl基因表達(dá)下調(diào)與raldh2基因表達(dá)下調(diào),NCCs發(fā)育抑制的表現(xiàn)非常相似,在第三部分,我們研究了tbxl基因表達(dá)與RA信號分子之間的關(guān)系。 通過原位雜交和real-time PCR的檢測,我們發(fā)現(xiàn),tbxl基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚中,RA合成酶基因-raldh2表達(dá)降低,而RA降解酶基因-cyp26al,cyp26b1, cyp26c1表達(dá)增強(qiáng),說明tbxl基因表達(dá)下調(diào)可以從合成和降解兩方面降低斑馬魚體內(nèi)RA的水平。 我們在體外人工合成斑馬魚raldh2mRNA,對tbxl基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚進(jìn)行拯救。實驗證明,外源raldh2基因可以拯救tbxl基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)果,異常的斑馬魚表型以及NCCs標(biāo)記基因的表達(dá)都大部分得到拯救。因此,我們得出結(jié)論,RA是介導(dǎo)tbxl基因?qū)CCs發(fā)育調(diào)節(jié)的“中間橋梁”,tbxl基因表達(dá)通過RA來調(diào)節(jié)NCCs的發(fā)育。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R725.9
【部分圖文】：

復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文 第一部分2.2 tbxl-MO的效率驗證將濃度為0.052 的tbxl-pEGFP N1重組質(zhì)粒單獨顯微注射入WT斑馬魚胚胎（n=50，重復(fù)2次），12 hpf，在勞光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色焚光(圖I-2A)。重組質(zhì)粒與tbxl-MO共同注射的胚胎（n=50，重復(fù)2次），12 hpf,在勞光顯微鏡下幾乎檢測不到綠色突光（圖I-2B)。以上結(jié)果證實tbxl-MO可以特異抑制斑馬魚tbxl基因的表達(dá)，即驗證了 tbxl-MO下調(diào)基因表達(dá)的特異性和有效性。

圖1-4 tbxl基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致crestin基因表達(dá)降低。背面觀。16馬魚中，NCCs已形成明顯的遷移流，幵始向咽弓遷移，crestin所條NCCs遷移流清晰可見，如星號所示（A)，在tm斑馬魚中，N移中的NCCs中表達(dá)明顯降低，其所標(biāo)記的三條遷移流幾乎消失，示（B)。19.5 hpf與24 hpf tm斑馬魚中crestin的表達(dá)較wt組明顯其是在頗部，如箭頭所示（C-F)。Figure 1-4 crestin was down-regulated in tbxl-kd zebrafish. Dorsal viewt zebrafish showed three migratory streams located by crestin, as sasterisks (A), 16 hpf, tm zebrafish showed reduced migratory streams,with arrow (B). At 19.5 hpf and 24 hpf, the reduced expression of crpersisted in tm zebrafish (C-F).2 tfap2a基因表達(dá)水平在tbxl-kd組斑馬魚中明顯降低

旦大學(xué)博士學(xué)位論文 部NCCs中表達(dá)明顯降低，NCCs遷移流不清晰，而在軀干NCCs中的（圖 I-5B)。19.5 hpf，WT組中，可見tfap2cx基因在中、后腦兩側(cè)遷移中的NC烈的表達(dá)（圖I-5C),而在tbxl-kd組中，tfap2a基因在相同區(qū)域的表達(dá)降低（圖I-5D)。24 hpf, WT組斑馬魚中，tfap2a基因很清晰地表達(dá)于后腦的菱腦5E),而在tbxl-kd組中，其在菱腦節(jié)的表達(dá)顯著減低，幾乎消失（圖tbxl-rescued斑馬魚中，tfap2a基因表達(dá)與WT組中相似（圖1-7 B)。我們發(fā)現(xiàn)，tbxl基因下調(diào)引起tfap2a基因在遷移中的NCCs的表達(dá)水crestin基因表達(dá)的改變相似，更說明在ttod-kd組斑馬魚中，NCCs的了抑制。A
【參考文獻(xiàn)】

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1 劉薇廷，寧壽葆，華邦杰，陳應(yīng)泰，周世瑜，郭安玲，陳樹寶，周愛卿，張子珊，周韋;上海市楊浦、徐匯區(qū)小兒先天性心臟病發(fā)病率及其特點[J];中華兒科雜志;1995年06期

本文編號：2867816