新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn,PPHN)是新生兒危重癥之一,缺氧是PPHN發(fā)生和病情惡化的重要危險(xiǎn)因素之一。目前調(diào)節(jié)血管張力的三條主要途徑為:一氧化氮(nitric oxide,NO)/環(huán)鳥甘單磷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)通路、前列環(huán)素/環(huán)腺甘單磷酸(cyclicadenosine monophosphate,cAMP)通路和內(nèi)皮素通路,尤其是NO/cGMP途徑是最近PPHN研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 作為一種重要的內(nèi)皮源性舒張因子,它除了激活鳥苷酸環(huán)化酶生成第二信使cGMP發(fā)揮生物學(xué)作用外,現(xiàn)在研究較多的是NO可通過蛋白質(zhì)巰基硝基化來執(zhí)行其生理功能。蛋白質(zhì)巰基硝基化是一種氧化還原依賴的蛋白質(zhì)翻譯后的可逆修飾。許多含有巰基的蛋白可以通過硝基化和去硝基化調(diào)節(jié)蛋白的生物學(xué)活性,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)的傳遞。亞硝基硫醇(nitrosothiols,RSNO)是含有硫醇的蛋白和小分子物質(zhì)硝基化的產(chǎn)物,是體內(nèi)NO的主要貯存體和載體。亞硝基硫醇濃度的變化和一系列生理病理的改變有關(guān)。 最近發(fā)現(xiàn)乙醇脫氫酶Ⅲ,能特異性分解亞硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione,GSNO),是目前所知的唯一一種能分解GSNO而不伴隨NO釋放的蛋白,故又把它命名為亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNO reductase,GSNOR)。GSNO是該蛋白的最佳底物。由于GSNO和其他亞硝基硫醇通過轉(zhuǎn)硝基反應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡中,所以GSNOR可以直接控制GSNO的水平,間接控制RSNO水平。三類一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,NOS)是NO和RSNO的主要來源。最近提出一種假說:內(nèi)源性NO/GSNO/SNO的平衡受NOS-GSNOR雙向調(diào)控。低氧性肺動(dòng)脈高壓與體內(nèi)反應(yīng)性氧化物過度增加、氧化還原平衡破壞和NO/RSNO的缺乏有關(guān)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)尤其是NOX2,4是血管內(nèi)生成活性氧簇((reactive oxygen species,ROS)的最主要酶體,在氧化還原信號(hào)的傳遞中起重要的調(diào)節(jié)作用。硫氫化鈉(NaHS)可以補(bǔ)充體內(nèi)的硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)舒張血管,同時(shí)也是一種重要的抗氧化劑,干預(yù)后可以改變機(jī)體的氧化還原狀態(tài)。 RSNO的分解異常與肺動(dòng)脈高壓的研究報(bào)道很少,其機(jī)制尚不清楚。本課題以野生型和eNOS基因敲除的C57BL/6J小鼠作為研究對(duì)象,建立常壓低氧的慢性肺動(dòng)脈高壓模型,探討GSNOR在低氧性肺動(dòng)脈高壓中的變化,同時(shí)觀察NOX2,4及ROS變化,以及NaHS干預(yù)等手段,對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步的探討,為肺動(dòng)脈高壓的治療探索一種新的途徑。 第一部分低氧性肺動(dòng)脈高壓與亞硝基谷胱甘肽還原酶的表達(dá) 目的: 1.在低氧性肺高壓形成過程中,GSNOR在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化及相應(yīng)的酶活性變化。 2.GSNOR的表達(dá)變化和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)之間的關(guān)系。 3.通過缺氧過程中氧化還原指標(biāo)還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值(glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG)和肺組織NO含量的變化,探討體內(nèi)氧化還原平衡與肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系。 方法: 1.模型建立和分組 缺氧組:將C57BL/6J小鼠置于密封有機(jī)玻璃箱中,調(diào)整氧氣和氮?dú)獾谋壤?使箱內(nèi)氧濃度維持在10%左右。 對(duì)照組:吸入FiO_2為0.21(即空氣),具體方法及實(shí)驗(yàn)控制因素同缺氧組。 2.評(píng)價(jià)模型是否成功 觀察隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),外周血pH值和紅細(xì)胞壓積的變化。測(cè)量缺氧21天后右心室收縮壓的變化,并用α-SMA免疫組化染色觀察肺血管的肌化程度,測(cè)量右心室與左心室加室間隔的比值[ratio of right ventricle to left ventricle plus septum,RV/(LV+S)]評(píng)價(jià)右心室肥厚情況。 3.熒光定量RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和缺氧1,3,7,14,21天小鼠肺組織GSNOR,eNOS和iNOS在mRNA水平的變化。免疫組化染色觀察GSNOR,eNOS和iNOS蛋白在小鼠肺組織內(nèi)的定位情況。Western blot檢測(cè)對(duì)照組和缺氧1,3,7,14,21天小鼠肺組織GSNOR和eNOS蛋白水平。用生物化學(xué)方法,檢測(cè)肺組織GSNOR活性的變化,GSH/GSSG比值及NO含量的變化。 結(jié)果: 1.缺氧21天后右心室收縮壓顯著上升(對(duì)照組:21.41±1.92 mmHg;缺氧組:32.64±3.56mmHg,P＜0.01)。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),血pH值下降(P＜0.01),紅細(xì)胞壓積逐漸上升(P＜0.01)。小動(dòng)脈的血管壁增厚,非肌型血管出現(xiàn)了不同程度的肌化。RV/(LV+S)的比值顯著增加(P＜0.01)。 2.GSNOR變化:GSNOR mRNA在缺氧第1天下降(P＜0.05),缺氧第3天和常氧組無顯著差異,缺氧第7天其表達(dá)水平為對(duì)照組的1.36倍(P＜0.01),隨后逐漸下降。GSNOR蛋白在缺氧第7天顯著上升(P＜0.05),14天達(dá)高峰,隨后下降。GSNOR酶活性在缺氧7天后顯著增加(P＜0.01)。 3.NOS變化:eNOS基因在缺氧3天后表達(dá)顯著增加(P＜0.01),14天達(dá)高峰,隨后下降。eNOS蛋白在缺氧3天后表達(dá)顯著上升。iNOS基因表達(dá)的變化和內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達(dá)變化相一致。 4.GSH/GSSG比值及NO含量的變化:缺氧后肺組織GSH/GSSG比值和NO含量均較基礎(chǔ)狀態(tài)出現(xiàn)了顯著的下降(分別為P＜0.05和P＜0.01) 結(jié)論: 1.缺氧誘導(dǎo)了GSNOR酶的活性持續(xù)升高,是缺氧后肺組織亞硝基硫醇缺乏的原因之一。 2.缺氧后eNOS和iNOS的表達(dá)增加,而肺組織硝酸根和亞硝酸根濃度下降提示缺氧會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)NO缺乏。 3.氧化還原平衡破壞參與了低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病。 第二部分低氧性肺動(dòng)脈高壓時(shí)亞硝基谷胱甘肽還原酶表達(dá)變化及調(diào)控機(jī)制研究 目的: 1.通過對(duì)eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧后及硫氫化鈉(NaHS)干預(yù)后肺小動(dòng)脈的重塑和右心室肥厚情況觀察,探討eNOS在肺小動(dòng)脈的重塑中的作用。 2.比較eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧及干預(yù)后GSNOR,iNOS,NOX2,NOX4在mRNA水平的差異。 3.通過對(duì)eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧后及干預(yù)后肺組織反應(yīng)性氧化物的變化,進(jìn)一步證明氧化還原平衡與低氧性肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系。 方法: 1.模型建立和分組 常氧組:同實(shí)驗(yàn)第一部分。 缺氧組:將野生型和eNOS基因敲除的C57BL/6J小鼠置于密封有機(jī)玻璃箱中,通入氧氣和氮?dú)?使箱內(nèi)氧濃度維持在10%左右。 干預(yù)組:低氧暴露方法同缺氧組,在缺氧前將硫氫化鈉(NaHS)用生理鹽水稀釋后,以14μmol/kg的劑量腹腔注射,隨后一天一次,持續(xù)21天。 對(duì)照組:低氧暴露方法同缺氧組,缺氧前用和干預(yù)組同劑量的生理鹽水腹腔注射,隨后一天一次,持續(xù)21天。 2.實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 比較野生型和eNOS基因敲除小鼠缺氧及NaHS干預(yù)21天后,肺小動(dòng)脈重塑(觀察media wall thickness,MT%)及右心室肥厚的變化。用RT-PCR方法檢測(cè)GSNOR,eNOS,iNOS,NOX2和NOX4在mRNA水平的變化,用生物化學(xué)法檢測(cè)肺組織反應(yīng)性氧化物濃度的變化。 結(jié)果: 1.野生型小鼠缺氧21天后,肺組織NOX2,4mRNA水平顯著上升(均為P＜0.01),ROS的濃度顯著下降(P＜0.01)。GSNOR的表達(dá)在缺氧第7天顯著上升(P＜0.05),隨后下降。 2.eNOS基因敲除小鼠缺氧21天后NOX2 mRNA的表達(dá)顯著下降(P＜0.01)而NOX4 mRNA無明顯變化。肺組織ROS的濃度無明顯變化。iNOS的表達(dá)顯著上升(P＜0.01),GSNOR的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。 3.野生型小鼠NaHS干預(yù)21天后,MT%和RV/(LV+S)顯著下降(分別為P＜0.05,P＜0.01)。野生型小鼠NaHS干預(yù)7天后,eNOS和iNOS的表達(dá)和缺氧7天組比較顯著下降(均為P＜0.01)。干預(yù)21天后NOX2和NOX4的表達(dá)顯著下降(均為P＜0.01),肺組織ROS的濃度和缺氧組比較略有上升,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。GSNOR的表達(dá)也出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05)。 4.eNOS基因敲除小鼠NaHS干預(yù)21天后RV/(LV+S)顯著下降(P＜0.05)而MT%變化不明顯。NaHS干預(yù)21天后,NOX2,4和iNOS mRNA的表達(dá)和缺氧21天組比較無差異。肺組織ROS的濃度顯著上升(P＜0.01),GSNOR的表達(dá)顯著增加(P＜0.01)。 結(jié)論: 1.通過缺氧21天,野生型和eNOS基因敲除小鼠均能成功建立肺動(dòng)脈高壓模型。兩者對(duì)缺氧的反應(yīng)程度一致,說明eNOS缺乏后會(huì)通過其他途徑發(fā)生代償。 2.eNOS基因敲除的小鼠缺氧后NOX2和GSNOR的表達(dá)下降,NOX4無明顯變化,提示eNOS對(duì)NOX和GSNOR的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。 3.NaHS對(duì)野生型小鼠肺血管重塑的逆轉(zhuǎn)作用比eNOS基因敲除的小鼠明顯,說明eNOS在NaHS舒張血管中起到了重要的作用。NaHS干預(yù)21天后,兩種小鼠肺組織ROS上升,GSNOR的異常表達(dá)被部分糾正。GSNOR的過度表達(dá)與氧化還原失衡有關(guān)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R722.1
【部分圖文】：

(l)右心室收縮壓和右心室肥厚指標(biāo)的變化對(duì)照組右心室平均收縮壓在(21.41士1.92)~Hg，缺氧21天后右心室平均收縮壓明顯升高達(dá)(32.64士3.56)~Hg，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1.1，p<0.01)o缺氧后，右心室出現(xiàn)了肥厚。缺氧7天后，右心室和左心室加室間隔的比值[rati。 ofrightventricletolenvent五 eleplusseptum，即/(LV+s)]的比值較對(duì)照組顯著性上升(P<0.01)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，RV/(LV+S)的比值進(jìn)一步上升。(見表1.7和圖 1.1，P<0.01)o表L7右心室肥厚指標(biāo)的變化組別RV/(LV+S) N0.245士0.023 H10.229士0.048 H30.253士0.035 H70.351士0.067* H140.374士0.034* HZ10.351土0.036* F18.30P<0.01注 :n=8，與對(duì)照組比較，*代表尸<0.01

r扭4犯l.2動(dòng)脈血pH值和紅細(xì)胞壓積的變化拍圖班萬注:與對(duì)照組比較，*代表尸<0.01(3)肺血管肌化程度的變化與對(duì)照組(圖1.3一A)相比，缺氧14天后(圖1.3一B)肺小動(dòng)脈的管壁增厚，血管肌化程度明顯增加。對(duì)照組小鼠只有肺小動(dòng)脈平滑肌層和小支氣管平滑肌層a一SMA表達(dá)陽性，缺氧后，非肌型血管如毛細(xì)血管和毛細(xì)血管前動(dòng)脈也有a一SMA陽性表達(dá)。

圖1.5對(duì)照組和缺氧21天組小鼠肺組織GSNOR的免疫組化染色。A、B對(duì)照組小鼠肺組織，GSNOR廣泛分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，氣道上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞C、O缺氧后，GSNOR染色陽性的細(xì)胞數(shù)增多。(3)各組肺組織GSNOR蛋白表達(dá)水平的變化在對(duì)照組中，GSNOR蛋白的表達(dá)水平很低，在缺氧第3天開始逐漸增加，第7天明顯增多(尸<0.05)，第14天達(dá)高峰，隨后下降但與對(duì)照組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見圖1.6)。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2864196