目的:嬰幼兒血管瘤(infantile hemangiomas,IH),為嬰幼兒最常見的良性腫瘤之一,發(fā)病率約5%-10%。IH的發(fā)病機(jī)制至今模糊,約50%以上的患兒可自行消退,部分患兒在治療后易出現(xiàn)色素沉著,同時(shí)伴有淺瘢痕、皮膚萎縮下垂等體征,嚴(yán)重者可能導(dǎo)致毀容,從而給患兒及家庭造成沉重的心理負(fù)擔(dān)。激素和普萘洛爾是目前口服治療IH的首要選擇,兩者在療效顯著的同時(shí),也面臨諸多副作用,因而更多有效的治療手段仍需進(jìn)一步探索。中醫(yī)中藥作為我國獨(dú)有的醫(yī)療特色,具有巨大的潛在治療價(jià)值,中藥的有效成分研究為疾病的治療提供了更多的可能性。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中IH歸屬外科之“血瘤”,長于肌膚分肉之間,多因著經(jīng)絡(luò)阻滯,營衛(wèi)不和、氣血凝滯所致,當(dāng)以活血化瘀為主,本研究擬從中醫(yī)學(xué)理論出發(fā)結(jié)合現(xiàn)代藥物化學(xué),篩選具有活性的中藥單體,為IH提供一種高效安全的治療選擇。我們在前期研究中選取萜類化合物進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)丹參提取的化合物抑制血管瘤作用明顯,隨后對丹參中主要的化合物進(jìn)行系統(tǒng)的分析,結(jié)果提示二氫丹參酮I(DHTS)在丹參提取的化合物中療效最佳,體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8)提示DHTS抑制血管瘤細(xì)胞的能力為普萘洛爾的近二十倍,故本研究旨在進(jìn)一步探索DHTS治療嬰幼兒血管瘤的作用機(jī)制,為臨床的藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。方法:利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Hochest33258染色觀察并探索DHTS對血管瘤細(xì)胞凋亡的影響,Western blot檢測其對血管瘤細(xì)胞凋亡通路中經(jīng)典蛋白的變化;采用血管成管實(shí)驗(yàn),在相差顯微鏡下觀察DHTS對血管瘤細(xì)胞血管生成的影響,并利用western blot檢測是否對血管生成過程的關(guān)鍵蛋白VEGFR2及MMP9的表達(dá)有影響;進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn),成瘤后,對裸鼠進(jìn)行腹腔藥物注射,觀察DHTS是否對體內(nèi)血管瘤具有抑制增殖的作用,同時(shí)設(shè)立普萘洛爾對照組,比較兩者的治療效果。結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在DHTS作用于血管瘤細(xì)胞后,流式細(xì)胞技術(shù)提示其能顯著引起血管瘤細(xì)胞早期凋亡,western blot提示DHTS在低濃度時(shí)更能誘發(fā)線粒體凋亡路徑,高濃度時(shí)誘發(fā)Fas/Fasl凋亡途徑;血管成管實(shí)驗(yàn)表明,DHTS能顯著抑制血管瘤細(xì)胞血管生成,同時(shí)抑制血管生成過程中的關(guān)鍵蛋白-VEGFR2及MMP9的生成;體內(nèi)裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)初步證明,DHTS能抑制體內(nèi)血管瘤的增殖,免疫組化提示其抑制作用可能與誘導(dǎo)血管瘤細(xì)胞凋亡及抑制血管生成相關(guān)。結(jié)論:DHTS對嬰幼兒血管瘤具有潛在的治療作用,體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步表明,DHTS作用效果顯著優(yōu)于普萘洛爾,其作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)血管瘤細(xì)胞凋亡,抑制血管瘤血管生成的過程發(fā)揮作用。
【學(xué)位單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R732.2
【部分圖文】：

2.2 結(jié)果2.2.1 二氫丹參酮 I 與普萘洛爾對血管瘤細(xì)胞的增殖影響為了比較 DHTS 與普萘洛爾體外抑制血管瘤細(xì)胞的效率，我們采用 CCK8 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，利用荷鼠自發(fā)的血管瘤細(xì)胞株（EOMA 細(xì)胞）為研究對象，分別用 0μM、0.37 μM、1.1μM、3.3μM、10μM 的 DHTS 及普萘洛爾進(jìn)行處理，結(jié)果提示普萘洛爾在低濃度狀態(tài)下對血管瘤細(xì)胞的抑制作用較微弱，遂改用 0 μM、3.7μM、11μM、33μM、100 μM 的濃度梯度進(jìn)行處理。結(jié)果提示：DHTS 的 IC50為2.63±0.16 μM，而普萘洛爾的 IC50值為 53.67±0.16 μM，前者的作用強(qiáng)度幾乎為后者的二十倍，普萘洛爾的濃度與文獻(xiàn)的報(bào)道基本相符合[61]。故我們可認(rèn)為 DHTS 在體外抑制血管瘤的作用顯著強(qiáng)于普萘洛爾。在后續(xù)的研究中，為了更好的探索兩者對血管瘤的作用機(jī)制，我們將選擇半數(shù)抑制濃度作為研究濃度（圖 2.1）

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文2.2.2 二氫丹參酮 I 與普萘洛爾對血管瘤細(xì)胞克隆形成的影響采用克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測 DHTS 及普萘洛爾對血管瘤細(xì)胞的抗增殖作用。消化EOMA 細(xì)胞后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成單細(xì)胞懸液，按照 500 個(gè)/2ml 細(xì)胞接種至 6 孔板，分為 DMSO 組、DHTS 及普萘洛爾處理組，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。一周后進(jìn)行細(xì)胞固定染色后觀察細(xì)胞克隆形成。結(jié)果顯示，DMSO 對照組（control）較處理組細(xì)胞克隆形成數(shù)目增多，效果明顯，如圖 2.2。表明 DHTS 及普萘洛爾抑制 EOMA 細(xì)胞的增殖及成瘤能力。

圖2.3 EOMA細(xì)胞被DHTS及propranolol處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。Figure 2.3 EOMA morphological characteristics changed by DHTS and propranolol treatmA:為空白對照組。B-C:為 2.5 μM及5 μM DHTS處理EOMA細(xì)胞24h，細(xì)胞形態(tài)的變化為50 μM及100μM propranolol處理EOMA細(xì)胞24 h，細(xì)胞形態(tài)的變化。其共同的特點(diǎn)殖速度減慢，形態(tài)發(fā)生相應(yīng)的變化：胞體變圓，細(xì)胞突起變短，胞漿內(nèi)產(chǎn)生較多顆
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2864041