研究背景與目的嬰幼兒血管瘤(infantile hemangioma,IH)是嬰幼兒期最常見的軟組織腫瘤,且發(fā)病率在過去30年呈穩(wěn)定增長趨勢,約3-5%。盡管大部分血管瘤呈早期快速增生隨之逐漸消退的自限性病程,但是處于快速增生期以及位于重要部位的血管瘤仍可導(dǎo)致破潰、出血、外觀及功能損害等嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至危及生命。增生期嬰幼兒血管瘤的典型病理表現(xiàn)包括致密的內(nèi)皮細(xì)胞團及壁厚微血管結(jié)構(gòu),并逐漸被纖維脂肪結(jié)構(gòu)所替代。嬰幼兒血管瘤的發(fā)病機制目前尚不明確,可能受組織缺氧、發(fā)育缺陷等外源性因素以及血管生成因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)等內(nèi)源性因素的共同調(diào)控。既往研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA),如長鏈非編碼 RNA(Longnon-coding RNA,LncRNA)、微小 RNA(microRNA,miRNA),在嬰幼兒血管瘤的疾病進程中至關(guān)重要,一些miRNA還可作為嬰幼兒血管瘤的潛在診斷標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)。環(huán)狀 RNA(circular RNA,circRNA)是一種新型 ncRNA,是由前體 mRNA選擇性剪接形成的閉合環(huán)形分子。近幾年,借助于高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展,之前被誤認(rèn)為是“剪接錯誤”的circR]NA被大量發(fā)現(xiàn),目前已經(jīng)成為ncRNA研究領(lǐng)域的重點。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)circRNA在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病中均存在顯著差異表達,并且可通過多種作用機制影響疾病進程。CircRNA所具有的高豐度、高穩(wěn)定性、序列保守性及組織、細(xì)胞特異性等特征,提示其在疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用�；诋�(dāng)前研究,CircRNA的作用機制主要包括以下4個方面:通過競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)機制或miRNA海綿作用,抑制miRNA活性,進而調(diào)控相關(guān)mRNA表達;競爭線性剪接或調(diào)控轉(zhuǎn)錄,影響親本基因表達;與RNA結(jié)合蛋白(RBP)等重要蛋白相互作用以調(diào)控基因表達;最近研究發(fā)現(xiàn)部分circRNA還具有翻譯功能。CircRNA在腫瘤發(fā)生以及血管性疾病等相關(guān)領(lǐng)域中的重要作用提示其在嬰幼兒血管瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能也具有重要的調(diào)控作用。目前circRNA在嬰幼兒血管瘤中的表達及功能尚無相關(guān)研究。明確circRNA在增生期嬰幼兒血管瘤中的表達,分析并探索其可能的功能及調(diào)控機制,有助于完善ncRNA在嬰幼兒血管瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究方法1.標(biāo)本收集:根據(jù)嚴(yán)格的納入及排除標(biāo)準(zhǔn),收集2015年6月到2017年5月的增生期血管瘤標(biāo)本及瘤旁皮膚組織共10對,PBS洗凈后置于RNALater中4°C過夜,轉(zhuǎn)至-20℃保存,用于芯片檢測及PCR驗證;留置部分標(biāo)本采用4%多聚甲醛固定,用于病理檢測。采用HE染色及GLUT1、CD31免疫組化染色驗證增生期嬰幼兒血管瘤的診斷及病理特征。2.CircRNA 芯片檢測及數(shù)據(jù)分析:采用 Arraystar Human circRNA V2 Array檢測4對增生期嬰幼兒血管瘤標(biāo)本及瘤旁組織circRNA表達譜。采用Trizol法分離提取總RNA,采用紫外線檢測法確定RNA樣品純度及濃度,通過變性瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品完整度。采用Rnase R消化除去線性RNA并富集circRNA。利用隨機引物法擴增富集的circRNA并轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。將標(biāo)記的cRNA雜交到 Arraystar Human circRNA V2 Array(8x15K,Arraystar)上。芯片采用 Agilent Scanner G2505C掃描。Agilent Feature Extraction軟件用于分析芯片圖像。R語言limma包進行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)t-檢驗差異倍數(shù)≥2.0且P0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。繪制火山圖、散點圖及聚類圖顯示差異表達的circRNA。3.qRT-PCR法驗證:采用實時熒光定量PCR技術(shù)對circRNA在10對增生期嬰幼兒血管瘤中的表達進行驗證,選擇6個顯著差異表達的circRNA(cricRNA_1 00933,circRNA_100709,circRNA_102116,circRNA_051239,circRNA_102039,circRNA_104310)進行檢測。采用 Primer 5.0 設(shè)計 circRNA 特異性背靠背引物。采用β-actin作為內(nèi)參基因。4.CircRNA功能分析:采用多種生物信息學(xué)技術(shù)分析差異表達的circRNA的潛在功能。通過MRE靶標(biāo)預(yù)測軟件(基于TargetScanmiRanda)分析circRNA/miRNA相互作用。采用miRWalk2.0預(yù)測miRNA下游靶基因,并結(jié)合增生期嬰幼兒血管瘤mRNA表達譜數(shù)據(jù),利用Cytoscape構(gòu)建circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)�；贒AVID以及KOBAS 3.0在線工具,采用GO和KEGG通路富集分析分別探索circRNA的親本基因以及其間接介導(dǎo)的circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在功能。5.初步功能驗證:選擇顯著上調(diào)的circRNA_100933作為目標(biāo)circRNA,構(gòu)建兩種RNAi慢病毒載體并轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;采用MTT法、克隆形成試驗及FACS法檢測circRNA_100933對細(xì)胞增殖及凋亡的影響;采用雙熒光素酶報告基因試驗驗證circRNA-100933與miR-137的結(jié)合位點;采用qRT-PCR法檢測circRNA_100933對miR-137的調(diào)控以及miR-137在增生期嬰幼兒血管瘤中的表達。采用 qRT-PCR 及 western blot 檢測 circRNA_100933 對 VEGFA 表達的影響。研究結(jié)果1.增生期嬰幼兒血管瘤的病理學(xué)特征:組織標(biāo)本GLUT1、CD31免疫組化染色呈陽性,嬰幼兒血管瘤診斷明確;HE染色顯示增生期嬰幼兒血管瘤以大量增生的內(nèi)皮細(xì)胞團及紊亂的微血管結(jié)構(gòu)為主。2.增生期嬰幼兒血管瘤circRNA表達譜鑒定:各樣本RNA質(zhì)量檢測合格,且cRNA標(biāo)記效率符合要求。聚類圖顯示circRNA在血管瘤與瘤旁組織中存在顯著差異表達,通過散點圖及火山圖共發(fā)現(xiàn)234個上調(diào)和374個下調(diào)的circRNA(FC≥2.0,P0.05)。其中外顯子型circRna占據(jù)最大比例,內(nèi)含子型circRNA次之。除chrY,各染色體中均有circRNA定位。3.差異表達的circRNA的qRT-PCR檢測結(jié)果:我們選擇了 6個顯著差異表達的circRNA進行驗證。其中cricRNA-100933,circRNA_100709在嬰幼兒血管瘤中顯著上調(diào),circRNA-104310在嬰幼兒血管瘤中顯著下調(diào),與芯片表達趨勢一致,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外三個circRNA(circRNA-102116,circRNA_051239,circRNA-102039)的變化趨勢與芯片結(jié)果變化方向一致,但缺乏統(tǒng)計學(xué)意義。4.差異表達的circRNA功能分析:采用MRE靶標(biāo)預(yù)測軟件對circRNA的miRNA結(jié)合位點進行預(yù)測,共發(fā)現(xiàn)1248個可能結(jié)合的miRNA,借助Cytoscape構(gòu)建circRNA/miRNA網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合文獻發(fā)現(xiàn)其中一些miRNA在嬰幼兒血管瘤中具有重要的調(diào)控作用。此外,通過對差異表達的circRNA的親本基因進行GO和KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生、血管發(fā)育相關(guān)功能及信號通路密切相關(guān)。最后,選擇顯著上調(diào)的circRNA_100933及顯著下調(diào)的circRNA_104310進行 circRNA/miRNA/mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。circRNA_100933 的 MRE 包括 miR-137,miR-1298-3p,miR-892b,miR-2113,miR-514a-5p;而 circRNA_104310 的 MRE 包括 miR-499a-3p,miR-1271-3p,miR-216a-3p,miR-197-3p,miR-489-3p。通過整合miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)及增生期嬰幼兒血管瘤mRNA表達譜數(shù)據(jù),分別獲得circRNA_100933間接介導(dǎo)的100個靶基因以及circRNA_104310間接介導(dǎo)的94個靶基因。GO和KEGG通路富集分析顯示circRNA_100933介導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)主要富集在上皮細(xì)胞遷移、血管發(fā)育等生物過程,以及VEGF信號通路、Rap1信號通路等。circRNA_104310介導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)則主要富集在細(xì)胞脂代謝、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等生物過程以及HIF-1α通路等重要信號通路。5.CircRNA_100933初步功能研究:選擇顯著上調(diào)的circRNA_100933進行初步功能研究發(fā)現(xiàn),敲減circRNA_100933可明顯抑制細(xì)胞增殖,并促進凋亡。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)circRNA_100933與重要的抑癌因子miR-137序列互補具有結(jié)合位點。PCR檢測示miR-137在嬰幼兒血管瘤中顯著下調(diào)。采用雙熒光素酶報告基因試驗證實circRNA_100933可通過預(yù)測位點結(jié)合miR-137。在細(xì)胞中敲減circRNA_100933可顯著上調(diào)miR-137表達,提示circRNA_100933可能具有miR-137海綿作用。VEGFA是嬰幼兒血管瘤中的重要調(diào)控因子。PCR檢測示VEGFA在嬰幼兒血管瘤中顯著上調(diào)。在細(xì)胞中敲減circRNA_100933可顯著下調(diào)VEGFA的mRNA及蛋白水平,提示circRNA_100933可能正向調(diào)控VEGFA表達。結(jié)論1.本研究采用芯片檢測技術(shù)首次鑒定了 circRNA在增生期嬰幼兒血管瘤及瘤旁組織中的表達,發(fā)現(xiàn)了大量差異表達的circRNA并采用qRT-PCR對6個差異表達的circRNA進行了驗證。大量circRNA在嬰幼兒血管瘤中的顯著差異表達提示其可能在嬰幼兒血管瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。2.基于芯片檢測結(jié)果,采用多種生物信息學(xué)分析手段對差異表達的circRNA進行功能分析。采用MRE靶標(biāo)預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)大量與circRNA具有互補結(jié)合位點的miRNA,并構(gòu)建circRNA/miRNA互作網(wǎng)絡(luò);采用GO分析及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)circRNA的親本基因參與多條腫瘤發(fā)生、血管發(fā)育相關(guān)的重要通路。以上兩方面結(jié)果共同提示circRNA可能通過不同作用機制在嬰幼兒血管瘤中發(fā)揮重要作用,本研究在后續(xù)實驗中初步探索了目標(biāo)circRNA的miRNA海綿作用,關(guān)于差異表達的circRNA是否可通過競爭線性剪切或結(jié)合重要蛋白而影響親本基因的表達仍有待未來進一步驗證。3.結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)及嬰幼兒血管瘤mRNA表達譜構(gòu)建了circRNA_100933/miRNA/mRNA 和 circRNA_104310/miRNA/mRNA 網(wǎng)絡(luò)。采用GO分析及KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)兩個互作網(wǎng)絡(luò)均富集于多條與嬰幼兒血管瘤密切相關(guān)的重要通路。4.基于PCR驗證及生物信息學(xué)分析結(jié)果,我們首次對顯著上調(diào)的circRNA_100933在細(xì)胞中的功能及miRNA海綿作用進行初步探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減circRNA_100933可顯著抑制細(xì)胞增殖,促進凋亡,并抑制重要因子VEGFA表達,提示其在嬰幼兒血管瘤中可能起著促瘤作用。此外,circRNA_100933還可通過互補位點結(jié)合miR-137并調(diào)控其表達,提示circRNA_100933可能通過miR-137海綿機制發(fā)揮作用。初步實驗結(jié)果提示circRNA_100933在嬰幼兒血管瘤中具有重要的研究價值,下一步仍需要進行更為深入的體外及體內(nèi)實驗進行驗證。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R732.2
【部分圖文】：

常組織間隔開，增生的紊亂微血管結(jié)構(gòu)鑲嵌其中。內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞表現(xiàn)為增大??的細(xì)胞核和豐富的透明細(xì)胞質(zhì)。ＧＬＵＴ－１及ＣＤ３１染色呈陽性。以下為兩例典型??增生期血管瘤的病理特征（圖１，２）??圖１．納入標(biāo)本的病理學(xué)特征（典型病例１）。Ａ．?ＨＥ染色示瘤體內(nèi)密集排列的內(nèi)??皮細(xì)胞團，中間可見形狀不規(guī)則的壁厚微血管結(jié)構(gòu)；Ｂ．免疫組化試驗示ＧＬＵＴ－１??陽性；Ｃ．免疫組化試驗示ＣＤ３１陽性（１００Ｘ）。??２２??

圖２．納入標(biāo)本的病理學(xué)特征（典型病例２）。??３．?３芯片檢測結(jié)果??３．?３．１?ＲＮＡ質(zhì)童檢測結(jié)果??分光光度計檢測所有標(biāo)本ＲＮＡ?ＯＤ２６０／２８０值都是１．８－２．?１區(qū)間內(nèi)，??ＯＤ２６０／２３０比值均大于１．８，質(zhì)檢合格（表２）。??變性瓊脂糖凝膠電泳檢測ＲＮＡ完整度。如圖３所示，未見明顯ＤＮＡ污染及??ＲＮＡ降解。??表２待測標(biāo)本ＲＮＡ質(zhì)檢結(jié)果??Ｓａｍｐｌｅ?ＩＤ?ＯＤ２６０／２８０?ＯＤ２６０／２３０?Ｃｏｎｅ．?＼ｂｌｕｍｅ?Ｑｕａｎｔｉｔｙ?ＱＣ?ｒｅｓｕｌｔ??Ｒａｔｉｏ?Ｒａｔｉｏ?（ｎｇ＾ｕｌ）?（ｕｌ）?（ｎｇ）??ｔｕｍｏｒｌ?ＴＯ?２２４?６０?４８７８９．００?Ｐａｓｓ??ｓｋｉｎｌ?１．８９?２．２８?３７９．９０?６０?２２７９４．００?Ｐａｓｓ??

分光光度計檢測所有標(biāo)本ＲＮＡ?ＯＤ２６０／２８０值都是１．８－２．?１區(qū)間內(nèi)，??ＯＤ２６０／２３０比值均大于１．８，質(zhì)檢合格（表２）。??變性瓊脂糖凝膠電泳檢測ＲＮＡ完整度。如圖３所示，未見明顯ＤＮＡ污染及??ＲＮＡ降解。??表２待測標(biāo)本ＲＮＡ質(zhì)檢結(jié)果??Ｓａｍｐｌｅ?ＩＤ?ＯＤ２６０／２８０?ＯＤ２６０／２３０?Ｃｏｎｅ．?＼ｂｌｕｍｅ?Ｑｕａｎｔｉｔｙ?ＱＣ?ｒｅｓｕｌｔ??Ｒａｔｉｏ?Ｒａｔｉｏ?（ｎｇ＾ｕｌ）?（ｕｌ）?（ｎｇ）??ｔｕｍｏｒｌ?ＴＯ?２２４?６０?４８７８９．００?Ｐａｓｓ??ｓｋｉｎｌ?１．８９?２．２８?３７９．９０?６０?２２７９４．００?Ｐａｓｓ??ｔｕｍｏｒ２?１．９７?２．１６?７９８．６１?１８０?１４３７４９．８０?Ｐａｓｓ??ｓｋｉｎ２?１．９７?２．２６?５３４．６４?６０?３２０７８．４０?Ｐａｓｓ??ｔｕｍｏｒ３?２．０４?２．２１?１４１３．３８?６０?８４８０２．８０?Ｐａｓｓ??ｓｋｉｎ３?１．９５?２．２７?５７４．１５
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Na Lv;Shuai Hao;Chonglin Luo;Alia Abukiwan;Ying Hao;Fei Gai;Weiwei Huang;Lingyun Huang;Xueyuan Xiao;Stefan B.Eichmüller;Dacheng He;;miR-137 inhibits melanoma cell proliferation through downregulation of GLO1[J];Science China(Life Sciences);2018年05期

本文編號：2862068