嬰兒肝衰竭綜合征1型(ILFS1)是一種由胞質(zhì)亮氨酰-t RNA合成酶基因(LARS)突變所導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病。本研究報道首例非白人ILFS1患者的臨床特點和分子診斷經(jīng)過,為ILFS1的診治提供參考�；颊邽�2歲9個月男孩,因發(fā)現(xiàn)肝脾腫大1年余就診。1歲5個月時發(fā)現(xiàn)肝脾大,實驗室檢查發(fā)現(xiàn)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶偏高、低蛋白血癥、凝血功能異常和貧血,肝臟病理提示肝硬化和脂肪肝;SLC25A13基因高頻突變篩查和一代測序分析僅檢測到一個父源性突變c.1658GA,cDNA克隆分析也未發(fā)現(xiàn)母源性SLC25A13等位基因異常轉(zhuǎn)錄子;代謝性肝病相關(guān)基因外顯子組捕獲二代測序在患兒LARS基因檢出父源性突變c.2133_2135del(p.L712del)和母源性突變c.1183GA(p.D395N),經(jīng)一代測序驗證,最終確診為ILFS1。目前隨訪至4歲,肝功能正常,無貧血,仍有低蛋白血癥。
【部分圖文】：

1.3SLC25A13cDNA克隆分析參考文獻[14]進行SLC25A13cDNA克隆分析。用淋巴細胞分離液（MPBiomedicals，美國）分離外周血淋巴細胞，加RNAisoplus（TaKaRa,日本）裂解細胞后，提取總RNA。以總RNA為模板，按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen,美國）說明書合成第一鏈cDNA。巢式PCR擴增SLC25A13基因編碼區(qū)，切膠純化PCR產(chǎn)物后與PMD18-TVector（TaKaRa,日本）進行連接克攏轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，涂布于加有Amp（50~100μg/mL）的LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，形成單菌落。隨機挑選單菌落，接種于含Amp的500μLLB液體培圖1肝臟組織病理檢查結(jié)果A（HE染色，100×）：肝內(nèi)大小不等的結(jié)節(jié)形成，纖維瘢痕及纖維間隔內(nèi)大量炎細胞浸潤，輕度界面炎，部分結(jié)節(jié)內(nèi)肝細胞大泡性脂肪變性；B（Masson染色，100×）：纖維組織增生分隔肝實質(zhì)（膠原纖維綠色，肌纖維紅色）；C（CK19染色，200×）：小膽管增生明顯（棕色，如箭頭所示）；D（Vimentin染色，200×）：竇周纖維化（棕色，如箭頭所示）。養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3~5h。取1μL菌液為模板，進行PCR擴增，電泳檢測有無目的條帶，并挑選24個陽性克隆菌液進行Sanger測序。1.4靶向外顯子組捕獲測序分析提取基因組DNA3~5μg，將其打斷、擴增，建立含有與代謝性肝病相關(guān)目標(biāo)基因（JAG1、ATP8B1、GALT、MUT、MMAA、MARS和LARS等共249個基因）的全基因組文庫，并對文庫樣本進行定量，保證文庫樣本總量在3μg以上。用液相捕獲試劑盒（MyGenostics,中國）捕獲目標(biāo)基因，利用測序儀HiSeq2000（Illumina,美國）進行高通量測序，平均深度不小于200×。獲取原始短序列，通過生物信息學(xué)分析單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）或插入/缺失（Indel），找出相關(guān)基因的突變信息。靶向外顯?

構(gòu)進行預(yù)測。2結(jié)果2.1SLC25A13基因突變分析和cDNA克隆分析結(jié)果SLC25A13基因高頻突變篩查和測序分析僅檢測到一個父源性的突變c.1658G>A。SLC25A13cDNA克隆分析結(jié)果顯示，來自父源性的等位基因的克隆子共有7個，均含有點突變c.1658G>A；而來自母源性的等位基因的克隆子共有17個，但未發(fā)現(xiàn)異常的轉(zhuǎn)錄子，因此排除了希特林缺陷病導(dǎo)致的新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥。2.2外顯子組捕獲測序和Sanger測序結(jié)果代謝性肝病相關(guān)的249個基因外顯子捕獲測序檢測到患兒LARS基因兩個突變c.2133_2135del和c.1183G>A。Sanger測序結(jié)果（圖2）證實，患兒為LARS基因c.2133_2135del和c.1183G>A突變的復(fù)合雜合子，前者來自父親，后者來自母親。2.3生物信息學(xué)分析結(jié)果突變c.1183G>A（p.D395N）和c.2133_2135del（p.L712del）在ExAC大數(shù)據(jù)庫中的人群頻率分別為0.005%和0.002%。比對包括人類、黑猩猩、狗、奶牛、大鼠、小鼠、雞、熱帶爪蟾和線蟲在內(nèi)的9種真核生物物種之間的LeuRS同源蛋白序列，結(jié)果顯示D395和L712均為保守氨基酸。兩種突變的MutationTaster分析均>0.9999，PROVEAN分析的分數(shù)分別為-4.92和-13.23；PolyPhen-2分析錯義突變c.1183G>A的分數(shù)為0.999，均提示此兩種突變可能為致病性突變。進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測時，p.D395野生型選取的蛋白結(jié)構(gòu)模型為人胞質(zhì)的亮氨酰-tRNA合成酶的編校結(jié)構(gòu)域（2WFD，258-509位氨基酸），序列一致性為99.21%[15]。采用SWISS-PdbViewer4.1.0軟件將p.D395野生型模型的第395位氨基酸由D變成N，突變后進行模型能量最小化，并比對兩者構(gòu)象的差異。第395位氨基酸由天冬氨酸變成天冬酰胺，使其附近氨基酸之間的氫鍵距離改變，同時伴有氫鍵生成和消失（圖3）。由于2WFD不能覆蓋L712，分析突變p.L712del的野生型和突?

第19卷第8期2017年8月中國當(dāng)代兒科雜志ChinJContempPediatrVol.19No.8Aug.2017·918·2.4診治經(jīng)過與結(jié)局根據(jù)患兒病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，考慮遺傳性肝病導(dǎo)致的肝硬化。行SLC25A13基因突變分析和cDNA克隆分析，排除希特林缺陷玻但病因仍不明，未予特殊治療。最終（3歲時）經(jīng)代謝性肝病相關(guān)基因外顯子組捕獲二代測序和Sanger測序驗證，確診為LARS基因突變導(dǎo)致的ILFS1。目前隨訪至4歲，肝功能正常，但仍有低蛋白血癥，無貧血，見表1；B超顯示肝內(nèi)回聲較前改善。圖3p.D395N突變前后空間結(jié)構(gòu)預(yù)測圖第395位氨基酸由天冬氨酸（A、B）變成天冬酰胺（C、D），使其附近氨基酸之間的氫鍵距離改變，同時伴有氫鍵生成和消失；T298和D399與附近氨基酸之間的氫鍵距離也受影響。綠色虛線表示氫鍵，相應(yīng)數(shù)字表示氫鍵距離。圖4p.L712del突變前后空間結(jié)構(gòu)預(yù)測圖A、B為野生型蛋白結(jié)構(gòu)模型，C、D為突變后蛋白結(jié)構(gòu)模型，第712位亮氨酸缺失破壞了709-713和753-755位氨基酸構(gòu)成的β折疊結(jié)構(gòu)，而位于第716-720位氨基酸的KMSKS模體與第155-164位氨基酸構(gòu)成的α螺旋結(jié)構(gòu)纏繞在一起（如C圖箭頭所示）。3討論本研究患兒主要表現(xiàn)為肝脾腫大以及出生體重偏低、肝功能異常、低蛋白血癥、貧血、凝血功能異常等，同時肝臟病理檢查顯示肝硬化和脂肪肝，這些表現(xiàn)均與希特林缺陷病的臨床特點相似[17]。此外，SLC25A13基因檢測還發(fā)現(xiàn)一雜合突變點c.1661G>A（p.R554Q），因此高度疑診希特林缺陷玻然而外周血淋巴細胞SLC25A13cDNA克隆分析在另一個等位基因上沒有發(fā)現(xiàn)異常的轉(zhuǎn)錄子，從而排除了希特林缺陷玻提示希特林缺陷病的診斷需要借助SLC25A13基因突變分析或mRNA分析等特異性手段[17-18]。該患者骨髓細胞學(xué)檢查、病原體檢查及自身免疫性
【參考文獻】

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本文編號：2851292