研究背景毛細(xì)支氣管炎(bronchiliotis)是由病毒感染引起的小細(xì)支氣管及其周圍組織的炎癥,根據(jù)不同的指南,其發(fā)病年齡從6個(gè)月到24個(gè)月不等,該病發(fā)病率在生后第一年可達(dá)20%～30%。臨床上,毛細(xì)支氣管炎的特點(diǎn)是呼吸困難、咳嗽、過(guò)度充氣、三凹征、哮鳴音或喘息。然而毛細(xì)支氣管炎是一種定義不明確且高度異質(zhì)性的疾病,其臨床表現(xiàn)、感染年齡、誘發(fā)因素以及潛在遺傳機(jī)制存在差異。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和鼻病毒(rhinovirus,RV)是引起毛細(xì)支氣管炎發(fā)病的主要致病因子,而80%及以上的毛細(xì)支氣管炎為RSV感染引發(fā),幾乎2歲之前所有兒童都感染過(guò)RSV。該類病毒感染機(jī)體可長(zhǎng)期作用于氣道,并引發(fā)日后氣道高反應(yīng)及喘息發(fā)作。早期患有毛細(xì)支氣管炎的兒童日后會(huì)增加哮喘的發(fā)病,部分隊(duì)列研究表明該發(fā)病的比例可高達(dá)30%～40%。如果毛細(xì)支氣管炎的致病因子是RSV,那么兒童發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加2-3倍。因此,RSV感染引起的毛細(xì)支氣管炎是后續(xù)哮喘發(fā)生的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但其致病機(jī)制仍不清楚。支氣管哮喘的特征是氣道慢性炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性,是由多種宿主與環(huán)境因素相互作用引起的,目前治療哮喘的主要藥物為糖皮質(zhì)激素,由于激素長(zhǎng)期應(yīng)用及遠(yuǎn)期副作用,不僅造成治療的依從性下降,而且增加了哮喘兒童及其家庭的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。毛細(xì)支氣管炎同樣引起氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性,且二者均存在Th1/Th2、Treg/Th17失衡,與哮喘存在類似的免疫功能紊亂。RSV目前被認(rèn)為是引發(fā)兒童后期喘息的早期標(biāo)志物。因此,更好地了解病毒感染的個(gè)人及環(huán)境因素可能是預(yù)防日后喘息發(fā)作的新策略,并可能會(huì)降低日后哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床上針對(duì)毛細(xì)支氣管炎的治療仍存在爭(zhēng)議,尚無(wú)有效及特異治療藥物,國(guó)際共識(shí)及國(guó)內(nèi)指南中較一致的是均不建議使用皮質(zhì)類固醇激素或抗生素。帕利珠單抗是一種針對(duì)RSV的單克隆抗體,早期預(yù)防接種能降低嚴(yán)重RSV感染,減少早產(chǎn)兒6年隨訪中的復(fù)發(fā)性喘息,但其不會(huì)影響日后哮喘的發(fā)病率。因此,尋找一種有效調(diào)節(jié)免疫功能并副作用小的治療毛細(xì)支氣管炎的藥物勢(shì)在必行�，F(xiàn)研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cell,MSCs)具有修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)特性,已成為潛在的細(xì)胞療法,并在某些肺部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中得到臨床應(yīng)用。人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs)相對(duì)其他MSCs更易獲得,更容易誘導(dǎo)免疫耐受,更接近于臨床。關(guān)于hPMSCs是否可以用于毛細(xì)支氣管炎患兒的臨床治療,及如何發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能作用,并減少日后哮喘的發(fā)病,目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Notch信號(hào)通路是一種高度保守的信號(hào)通路,在CD4+T細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)的受體與配體結(jié)合后可相互作用,從而調(diào)控Th細(xì)胞因子的產(chǎn)生和極化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,阻斷Notch信號(hào)通路后可緩解RSV毛細(xì)支氣管炎大鼠氣道炎癥,減輕Th1/Th2細(xì)胞失衡。有研究表明,hPMSCs對(duì)Notch信號(hào)的表達(dá)起到重要的免疫調(diào)控作用。基于此,我們認(rèn)為hPMSCs可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)的表達(dá)來(lái)調(diào)控毛細(xì)支氣管炎大鼠的發(fā)病,可是hPMSCs參與毛支發(fā)病的機(jī)制和具體效應(yīng)有待深入研究。本研究通過(guò)臨床及基礎(chǔ)研究?jī)刹糠謨?nèi)容,來(lái)評(píng)估不同程度RSV毛細(xì)支氣管炎患兒免疫功能紊亂及對(duì)日后喘息發(fā)生的影響,并評(píng)價(jià)hPMSCs移植后對(duì)大鼠毛細(xì)支氣管炎模型Th細(xì)胞平衡、Notch信號(hào)通路的影響,探討hPMSCs調(diào)節(jié)RSV毛細(xì)支氣管炎免疫功能的分子學(xué)機(jī)制,為毛細(xì)支氣管炎尋找新的臨床治療方法提供理論依據(jù)。第一部分不同嚴(yán)重程度RSV毛細(xì)支氣管炎患兒免疫失衡及對(duì)日后哮喘發(fā)生的影響目的 比較健康兒童與不同嚴(yán)重程度RSV毛細(xì)支氣管炎患兒急性期外周血CD4+T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Treg、Th17細(xì)胞百分比及相關(guān)細(xì)胞因子水平,隨訪RSV毛細(xì)支氣管炎患兒4歲齡時(shí)哮喘的發(fā)生情況以及外周血Th1、Th2細(xì)胞因子、IgE水平變化,了解不同嚴(yán)重程度RSV毛細(xì)支氣管炎患兒體內(nèi)免疫失衡狀態(tài)及對(duì)日后哮喘發(fā)生的影響。方法 選取RSV 陽(yáng)性毛細(xì)支氣管炎患兒68例,正常對(duì)照組30例。其中輕度毛細(xì)支氣管炎組32例,中重度毛細(xì)支氣管炎組36例。采用流式細(xì)胞術(shù)方法(FCM)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中Th1、Th2、Treg、Th17細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17水平。隨后采用哮喘調(diào)查表、電話、來(lái)院復(fù)查相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪,記錄輕度組、中重度組毛細(xì)支氣管炎患兒4歲齡哮喘的發(fā)病情況。采用ELISA方法檢測(cè)兩組隨訪組患兒外周血血清中IFN-y、IL-4水平,化學(xué)發(fā)光法測(cè)定外周血血清中IgE水平。結(jié)果 1.相較于正常對(duì)照組,輕度毛細(xì)支氣管炎組患兒Th1亞群細(xì)胞百分比、IFN-γ相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P0.05),Th2亞群細(xì)胞百分比、IL-4表達(dá)明顯增加(P0.05);中重度毛細(xì)支氣管炎組較輕度毛細(xì)支氣管炎組Th1亞群細(xì)胞百分比、IFN-y相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P0.05),Th2亞群細(xì)胞百分比、IL-4表達(dá)量明顯升高(P0.05)。2.輕度毛細(xì)支氣管炎組較正常對(duì)照組PBMC中Treg細(xì)胞亞群百分比、IL-10明顯下降(P0.05),Th17細(xì)胞亞群百分比、IL-17升高(P0.05);相較于輕度毛細(xì)支氣管炎組,中重度毛細(xì)支氣管炎組PBMC中Treg細(xì)胞亞群百分比、IL-10明顯降低(P0.05),Th17細(xì)胞亞群百分比、IL-17水平升高(P0.05)。3.成功隨訪50例毛細(xì)支氣管炎患兒,其中輕度毛細(xì)支氣管炎后發(fā)生哮喘患兒2例,非哮喘患兒22例(輕度隨訪組共24例);中重度毛細(xì)支氣管炎后哮喘患兒8例,非哮喘患兒18例(中重度隨訪組共26例),輕度隨訪組哮喘發(fā)病率與中重度隨訪組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.相較于正常對(duì)照組,輕度隨訪組、中重度隨訪組患兒血清中IFN-γ的表達(dá)水平有降低趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。相較于正常對(duì)照組,輕度隨訪組血清中IL-4的表達(dá)水平有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而中重度隨訪組血清IL-4的表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.輕度隨訪組血清中IgE表達(dá)有上升趨勢(shì),但其表達(dá)值在正常范圍內(nèi);而中重度隨訪組表達(dá)顯著升高,其均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常值,相較于輕度隨訪組血清IgE表達(dá)量明顯增高(P0.05)。結(jié)論 1.毛細(xì)支氣管炎患兒急性期存在Th1/Th2細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子的改變;2.毛細(xì)支氣管炎患兒急性期存在Treg/Th17細(xì)胞失衡及相關(guān)細(xì)胞因子的改變;3.毛細(xì)支氣管炎患兒病情越嚴(yán)重,Th1/Th2、Treg/Th17細(xì)胞失衡越明顯;4.RSV感染后可造成患兒的長(zhǎng)期損傷,導(dǎo)致IL-4以及IgE的表達(dá)量升高;5.初診時(shí)RSV毛細(xì)支氣管炎病情嚴(yán)重程度與日后哮喘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能相關(guān)。第二部分 毛細(xì)支氣管炎大鼠Notch信號(hào)通路的變化及hPMSCs移植的影響目的 建立大鼠毛細(xì)支氣管炎模型和hPMSCs干預(yù)模型,研究hPMSCs對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)毛細(xì)支氣管炎大鼠的影響及可能機(jī)制。方法 SD大鼠30只隨機(jī)分為RSV毛細(xì)支氣管炎組、hPMSCs移植組、正常對(duì)照組,培養(yǎng)并鑒定hPMSCs,利用RSV滴鼻誘導(dǎo)建立RSV毛細(xì)支氣管炎大鼠模型,采用尾靜脈注射hPMSCs建立hPMSCs干預(yù)模型,觀察各組大鼠癥狀、氣道炎癥改變、氣道高反應(yīng)性、BALF細(xì)胞分類,檢測(cè)肺組織Th1、Th2相關(guān)蛋白,血液、肺組織、淋巴液中Notch信號(hào)相關(guān)受體及配體在各組大鼠中的表達(dá)水平。結(jié)果 1.觀察記錄到正常對(duì)照組大鼠表現(xiàn)基本正常,RSV毛細(xì)支氣管炎組及hPMSCs移植組大鼠在造模后均出現(xiàn)不同程度的毛細(xì)支氣管炎樣發(fā)作癥狀,在整個(gè)造模及藥物干預(yù)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。2.HE染色顯示支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)在正常對(duì)照組大鼠的表現(xiàn)大致正常,RSV毛細(xì)支氣管炎組支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn);與RSV組比較,hPMSCs移植組炎癥反應(yīng)程度減輕。3.RSV毛細(xì)支氣管炎組AHR、BALF細(xì)胞總數(shù)較正常對(duì)照組、hPMSCs移植組明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.與正常對(duì)照組小鼠相比,RSV毛細(xì)支氣管炎組肺勻漿中T-bet的相對(duì)含量降低、GATA-3的相對(duì)含量升高(P0.05);與RSV毛細(xì)支氣管炎組相比,hPMSCs移植組T-bet的相對(duì)含量升高、GATA-3的相對(duì)含量降低(P0.05)。5.RSV毛細(xì)支氣管炎組相較于hPMSCs與正常對(duì)照組,肺組織中Notch1、Notch2、Jaddged1蛋白的表達(dá)顯著升高(P0.05),Notch3、Delta4蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05)。6.hPMSCs移植組相較于RSV毛細(xì)支氣管炎組,血液、肺組織、淋巴液中 Notch1、Notch2、Jaddged1mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),Notch3、Delta4mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P0.05)。結(jié)論 1.毛細(xì)支氣管炎大鼠模型及hPMSCs干預(yù)模型誘導(dǎo)成功;2.Notch信號(hào)參與了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病;3.hPMSCs可能通過(guò)下調(diào)Notch信號(hào)的表達(dá)從而減輕毛細(xì)支氣管炎的嚴(yán)重程度。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R725.6
【部分圖文】：

毛細(xì)支氣管炎各組外周血ＩＦＩＮ－丫、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７的變化??上述流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果己表明毛細(xì)支氣管炎發(fā)病時(shí)存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２、??ｒｅｇ／Ｔｈｌ７細(xì)胞亞群比例失衡，眾所周知，Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ及Ｔｈｌ７細(xì)胞的特細(xì)胞因子ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７的表達(dá)在其免疫學(xué)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要。因此，我們又利用ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)了其特異性細(xì)胞因子（ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０－１７）的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)外周血中Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ、Ｔｈｌ７細(xì)胞的表達(dá)水果顯示（見(jiàn)圖２）：??各組中ＩＦＮ－ｙ因子結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)與各組中Ｔｈｌ細(xì)胞亞群百分比表達(dá)趨勢(shì)相：相較于正常對(duì)照組，輕度毛細(xì)支氣管炎組ＩＦＮ－Ｙ的相對(duì)表達(dá)量降低（１３．１７±２．ｌ５．８２±１．３２ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）；相較于輕度毛細(xì)支氣管炎組，中重度毛細(xì)支炎組?ＩＦＮ－丫表達(dá)下降（９．０８±０．８９ｗｌ３．１７±２．０１ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）。??各組中ＩＬ－４因子結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)與各組中Ｔｈ２細(xì)胞亞群百分比表達(dá)趨勢(shì)相－

山東大學(xué)博士學(xué)位論文???較輕度毛細(xì)支氣管炎組降低Ｐ＜０．０５）。??各組中ＩＬ－１７因子結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)與各組中Ｔｈｌ７細(xì)胞亞群百分比表達(dá)趨勢(shì)相??：相較于正常對(duì)照組，輕度毛細(xì)支氣管炎組ＩＬ－１７含量升高（４０．７６±３．２８ｗ??±４．３７ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）；中重度毛細(xì)支氣管炎組ＩＬ－１７表達(dá)較輕度毛細(xì)支氣??組升高（４８．３８±５＿１６ｗ４０．７６±３．２８ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）。??１８０－１??

較于中重度毛細(xì)支氣管炎組，中重度隨訪組患兒血清中ＩＦＮ－ｙ的表達(dá)１４．６９±２．８１?ｗ?９．０８±０．８９ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５），ＩＬ－４?的表達(dá)明顯降低（８７．７２±８．３７±１３．５７ｐｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５），見(jiàn)圖?３－２。??１４０??Ｅ?１２０－??Ｔ??Ｓ?１００?ｍＬ｜?＊??１?８〇＂?１??１?６〇￣?■?＿中顧毛翅??＇土?４〇－．?■中重度隨訪組??§２０?－?—??〇??????＾…???ＩＦＮ－ｙ?ＩＬ－４??圖３－２中重度毛支組及中重度隨訪組ＩＦＮ－ｖ、ＩＬ－４水平比較??注：＊Ｐ＜０．０５?ｉ／ｓ中重度毛支組??
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