發(fā)布時間：2020-10-17 10:43

　　 創(chuàng)傷性疾病在現(xiàn)代社會已成為嚴(yán)重威脅兒童身體健康的疾病,并且發(fā)病率越來越高。腦外傷后新生血管的建立是兒童腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞再生的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在血管新生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,但具體的分子機(jī)制尚不明確。因此對其進(jìn)一步的研究將有助于我們了解星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)血管新生中的確切作用機(jī)制。本研究通過誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化建立純度極高的星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,并利用此方法培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞制作劃傷模型來模仿在體狀態(tài)下的腦外傷,然后提取其上清培養(yǎng)液用來培養(yǎng)腦的微血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察此培養(yǎng)條件下的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài),增殖及屏障特性的變化來了解兒童大腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞在血管新生過程中發(fā)揮的作用。 第一部分 星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng) 目的利用神經(jīng)干細(xì)胞可分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性建立一種新的星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)純化的方法。 方法通過誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的新生小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞,并運(yùn)用差速貼壁和恒溫?fù)u床振蕩的方法進(jìn)行純化,并且與經(jīng)典的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞標(biāo)記分子,純度,生長趨勢和對損傷的反應(yīng)等生物學(xué)特性的對比。應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。 結(jié)果經(jīng)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí),誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)與純化得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度可以達(dá)到99.4±0.5%,而傳統(tǒng)方法得到的細(xì)胞純度為94.2±2%,兩種方法培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài),細(xì)胞標(biāo)記分子,純度,生長趨勢和對損傷的反應(yīng)等生物學(xué)特性方面無明顯差異。 小結(jié)誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與純化可以得到純凈的星形膠質(zhì)細(xì)胞,與常規(guī)方法比較兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞在生物學(xué)特性方面無明顯差異并且此方法具有易制備易純化的特點(diǎn),因此可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的一種新方法。 第二部分 劃傷星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 目的分別研究劃傷和未劃傷兩種條件下的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài),CCK-8增殖實(shí)驗(yàn),毛細(xì)血管樣管腔形成能力和跨內(nèi)皮阻抗的測定的影響,初步探討劃傷星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。 方法(1)實(shí)驗(yàn)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組為劃傷星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組；對照組為未劃傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞組；(2)采用CCK-8試劑盒檢測兩組細(xì)胞增殖狀態(tài)的變化；觀察兩組細(xì)胞在Matrigel鋪板的毛細(xì)血管樣管腔形成能力；利用應(yīng)用Millicell ERS系統(tǒng)在37℃恒溫下檢測兩組的跨內(nèi)皮電阻抗值(TEER)的變化。(3)應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示。組間比較采用One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析,組間比較采用LSD檢驗(yàn)。 結(jié)果(1)培養(yǎng)24小時候后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在不同時間點(diǎn)的吸光度值明顯低于對照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)在Matrigel包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)20小時兩組內(nèi)皮細(xì)胞觀察毛細(xì)血管樣管腔形成能力,實(shí)驗(yàn)組用劃傷后1、3、7天的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)20小時管腔樣結(jié)構(gòu)形成的個數(shù)為15.1±2.55；14.3±2.39；15.2±3.03；對照組在相應(yīng)時間點(diǎn)上的毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)的個數(shù)分別為22.0±3.16；20.6±3.79；21.3±1.95；各時間點(diǎn)上的管腔樣結(jié)構(gòu)個數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而同一組內(nèi)不同時間點(diǎn)管腔樣結(jié)構(gòu)個數(shù)在第三天略有上升但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(3)細(xì)胞培養(yǎng)24h測得的跨內(nèi)皮電阻抗值分別在劃傷后第1、3、7天的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中每個時間點(diǎn)的TEER值(對照組分別為389±24.9；415±22.9；406±13.8；實(shí)驗(yàn)組分別為227±19.4；240±21.3；230±17.0)之間差異顯著(P0.01),但每一組在不同時間點(diǎn)的TEER值變化不大,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 小結(jié)(1)實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞體積變小,形態(tài)仍呈梭形,折光性無明顯改變。(2)實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)液可降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的吸光度值和毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成的能力,并減弱了內(nèi)皮細(xì)胞的屏障特性。 結(jié)論 1.誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與純化可以得到純凈的星形膠質(zhì)細(xì)胞,此方法培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在生物學(xué)特性方面與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的細(xì)胞無明顯差異并且此方法具有易制備易純化的特點(diǎn),因此可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的一種新方法。 2.實(shí)驗(yàn)組條件培養(yǎng)液對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)影響不明顯,但可明顯減弱其增殖活性,毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成的能力和內(nèi)皮細(xì)胞的屏障特性。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2010
【中圖分類】：R726.5
【部分圖文】：

圖2星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色A:對照纖王星)}么細(xì)J泡(KIOO，綠色為GFAP，藍(lán)色為DAPI)B:‘士了}念夕目星)I于細(xì))}f認(rèn)3.不同時間點(diǎn)兩組細(xì)胞計(jì)數(shù):由表1可以看出，相同時間點(diǎn)誘導(dǎo)分化纖!.的細(xì)密度稍大，隨培養(yǎng)時間的延長而增大，并目_由生長曲線和生長趨勢兩圖表以看到兩組細(xì)胞生長趨勢二」卜常接近，兩組統(tǒng)計(jì)分析所有時l’llJ點(diǎn)的P>0.05，差無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表1星形膠質(zhì)細(xì)胞生長情況的比較別細(xì)胞密度(104/ml)1天2大3天4天6天23.8士1.1838.4士1.5244.9士1.8365.25天士3.1774.5士1625.6士1.7240.2士12075.0士l，8nUn釗44曰l曰se45.4士1.4668.1士1.39
【參考文獻(xiàn)】

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1 侯家驥，潘愛英，劉秀麗，劉秉鈞;不同年齡大鼠大腦皮質(zhì)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;1995年01期

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本文編號：2844674