嬰幼兒血管瘤是一種嬰幼兒期較為常見的內(nèi)皮細(xì)胞良性腫瘤。該腫瘤通常具有增殖期、消退期和消退完成期的臨床病理特征�；颊咴诔錾�3-6個月發(fā)病并迅速進(jìn)入增殖期。該病一般在患者3-7歲可自發(fā)出現(xiàn)消退。在增殖期,由于血管瘤內(nèi)血流量迅速增加,瘤體快速增殖,可使腫瘤體積明顯增大,從而對周圍組織器官造成壓迫癥狀。多發(fā)者可伴隨其它相關(guān)病理表現(xiàn)。在消退期,腫瘤瘤體停止生長,并自發(fā)消退。多數(shù)患兒可不殘留明顯皮膚改變。但部分嬰幼兒血管瘤因其深在,或者并發(fā)其他疾病,可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥。某些病例中最終殘留的病變可影響患兒正常生活。目前對于嬰幼兒血管瘤的治療方法已逐漸統(tǒng)一,但是還沒有一種治療方法是完全有效和沒有副作用的。這主要是因為對于其發(fā)病機制還沒有完全研究清楚。目前普遍認(rèn)為,相對于增殖期,消退期的嬰幼兒血管瘤中內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是一個重要的促進(jìn)因素。miRNA又稱為微小RNA,是一類自然界中普遍存在的小分子RNA。該類RNA對于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,調(diào)控細(xì)胞和組織分化有重要意義。該類RNA并不通過編碼蛋白質(zhì)發(fā)揮作用,而是通過識別特定靶目標(biāo)的m RNA,降解m RNA或部分抑制m RNA的表達(dá),從而抑制靶目標(biāo)蛋白的形成和發(fā)揮作用。目前有諸多文獻(xiàn)均認(rèn)為,在腫瘤中miRNA與細(xì)胞凋亡有著重要的關(guān)系。在前列腺癌中[1],miRNA-34可以下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),從而抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在惡性膠質(zhì)瘤中[2],miRNA-153可以通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在直腸癌中[3]存在著低表達(dá)的miRNA-195。通過在直腸癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)miRNA-195,可以促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的凋亡。我們之前對增殖期及消退期的嬰幼兒血管瘤組織進(jìn)行差異micro RNA芯片檢測和篩選,發(fā)現(xiàn)mi R-29a-3p在不同期的組織中差異明顯,且在消退期的嬰幼兒血管瘤組織中明顯高表達(dá)。同時,在諸多文獻(xiàn)中,均發(fā)現(xiàn)mi R-29家族成員可以通過作用于凋亡相關(guān)因素而抑制腫瘤的發(fā)展。通過實驗[4]發(fā)現(xiàn),在惡性肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中,mi R-29a可調(diào)控抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的凋亡。在慢性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌、乳腺癌中,mi R-29a均表達(dá)下調(diào)。上調(diào)mi R-29a表達(dá)可以激活P53的表達(dá),并抑制CDC42、Tcl-1等多種增殖相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過本研究,我們試圖探討mi R-29a對嬰幼兒血管瘤生物活性的影響,以及在嬰幼兒血管瘤消退中的作用及其機制。以期對進(jìn)一步了解嬰幼兒血管瘤自發(fā)消退的機制有所裨益。第一部分:嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定實驗?zāi)康耐ㄟ^原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法,獲得可用于實驗的增殖期嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。實驗方法1、無菌條件下收集手術(shù)中新鮮的增殖期嬰幼兒血管瘤標(biāo)本,于6小時內(nèi)轉(zhuǎn)入實驗室超凈臺中。以組織塊貼壁培養(yǎng)法處理并培養(yǎng)血管瘤組織。培養(yǎng)數(shù)周后,獲取其周圍爬出的細(xì)胞,通過酶消化法收集。經(jīng)過傳代再培養(yǎng)。傳至3-4代,細(xì)胞量足夠時,收集并以CD31免疫磁珠分選,獲得CD31陽性細(xì)胞。將細(xì)胞進(jìn)行CD31-FITC的流式細(xì)胞學(xué)檢驗,以保證陽性細(xì)胞率達(dá)90%以上。2、將獲得的高純度的CD31陽性細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),在倒置相差顯微鏡下觀察其生長形態(tài),并繪制生長曲線,行Matrigel基質(zhì)膠成管實驗,以確定該細(xì)胞的生長特性。3、通過CD31、v WF、Glut-1、VEGFA的細(xì)胞表面標(biāo)志物免疫熒光檢測,以明確該細(xì)胞為可用于下一步實驗的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。實驗結(jié)果1、通過對增殖期嬰幼兒血管瘤新鮮標(biāo)本組織塊的培養(yǎng),細(xì)胞的收集、擴增、傳代、并經(jīng)CD31免疫磁珠分選,獲得了足夠量的細(xì)胞。通過CD31-FITC的流式細(xì)胞學(xué)檢驗,所獲得CD31陽性細(xì)胞率為96%左右。2、獲得的細(xì)胞通過培養(yǎng),在倒置相差顯微鏡下觀察,可見其形態(tài)為梭形,生長較為雜亂。生長曲線顯示其具有較為旺盛的增殖活性。Matrigel基質(zhì)膠成管實驗顯示其具有早期成管能力。3、通過CD31、v WF、Glut-1、VEGFA的細(xì)胞表面標(biāo)志物免疫熒光檢測,可見該細(xì)胞上述表面標(biāo)志物表達(dá)均為較強陽性。實驗結(jié)論我們通過收集增殖期嬰幼兒血管瘤標(biāo)本,并經(jīng)體外擴增培養(yǎng)并獲得細(xì)胞。經(jīng)形態(tài)學(xué)及免疫熒光抗體檢測,其特征均符合文獻(xiàn)的一般描述,證實為所需嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,該細(xì)胞純度較高,活力較強,可用于下一步實驗。第二部分:上調(diào)mi R-29a對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物活性的影響實驗方法1、體外構(gòu)建能夠轉(zhuǎn)染并可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)mi R-29a的慢病毒顆粒Lv-hsa-mi R-29a及陰性對照病毒Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin。2、以自身細(xì)胞作為陰性對照組,以Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性病毒轉(zhuǎn)染組,以Lv-hsa-mi R-29a轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為慢病毒轉(zhuǎn)染組。通過熒光顯微鏡觀察其熒光表達(dá)情況。通過q RT-PCR檢測細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前后mi R-29a表達(dá)的變化,從而確定其轉(zhuǎn)染效率。3、在嬰幼兒血管瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)mi R-29a后,采用MTT法檢測其增殖能力的改變。流式細(xì)胞儀檢測其周期及凋亡水平的改變,Transwell侵襲法檢測其侵襲能力的改變,以研究過表達(dá)mi R-29a對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生物活性的影響。實驗結(jié)果熒光顯微鏡下觀察,FITC熒光表達(dá)顯示mi R-29a轉(zhuǎn)染效果良好,轉(zhuǎn)染效率約為95%左右。q RT-PCR結(jié)果顯示mi R-29a在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)豐度為中等,轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒后,mi R-29a基因的表達(dá)豐度是陰性對照組的2.643倍。轉(zhuǎn)染病毒后72h,過表達(dá)mi R-29a的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中,其早期凋亡率約為10.82%,較陰性對照組及陰性病毒轉(zhuǎn)染組有顯著性差異。其晚期凋亡率約為1.72%,較陰性對照組有顯著性差異。而細(xì)胞周期、侵襲及增殖實驗結(jié)果均無顯著性差異。實驗結(jié)論通過轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒Lv-hsa-mi R-29a,可以構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)mi R-29a的細(xì)胞模型。過表達(dá)mi R-29a后,嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率有顯著性變化.。而對于細(xì)胞周期、增殖及侵襲均無顯著性影響。第三部分:mi R-29a在嬰幼兒血管瘤中作用機制的研究實驗方法1、以mi R-29a過表達(dá)后的嬰幼兒血管瘤細(xì)胞作為目標(biāo)樣本,以自身細(xì)胞作為陰性對照,采用miRNA基因表達(dá)譜芯片篩選的方法,獲得兩者之間有較大表達(dá)差異的m R NA表達(dá)譜。通過與Target Scan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,結(jié)合之前細(xì)胞功能學(xué)研究結(jié)果,參考相關(guān)文獻(xiàn),選取可能為mi R-29a下游的靶基因作驗證。2、通過雙熒光素酶檢測顯示,mi R-29a的下游作用分子可能為Mcl-1分子。3、通過Western-blot檢測的方法,進(jìn)一步驗證在過表達(dá)mi R-29a的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平是否有顯著性變化。4、通過查閱文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫,我們選取Stat3及Akt3這兩個可能同時是Mcl-1上游及mi R-29a下游靶蛋白的分子加以驗證,進(jìn)一步研究mi R-29a是否通過調(diào)控Mcl-1上游分子表達(dá)以調(diào)控Mcl-1表達(dá)的可能。實驗結(jié)果參考miRNA芯片篩選、數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn),我們獲取相關(guān)分子作為mi R-29a可能的下游靶蛋白并進(jìn)行驗證。通過雙熒光素酶檢測確定Mcl-1具有與mi R-29a結(jié)合的相關(guān)位點,其為mi R-29a可能的下游分子。通過Western-blot檢測,證實了Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白水平均有顯著性變化。同時,通過Western-blot檢測,證實了Stat3及Akt3蛋白水平無顯著性變化。實驗結(jié)論雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),mi R-29a與Mcl-1是直接相互作用并且可以找出相互作用的結(jié)合位點。通過Western-blot檢測,在過表達(dá)mi R-29a的嬰幼兒血管瘤血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中,Mcl-1、VEGFA及Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。而mi R-29a與Mcl-1的上游分子Stat3和Ark3沒有表達(dá)相關(guān)性,mi R-29a并不能抑制或者激活Stat3和Ark3的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R732.2
【部分圖文】：

圖 1-1 表 1 中所列的病例照片。a 右腰部嬰幼兒血管瘤病例；b 左手背嬰幼兒血管瘤病例；c 右顳部嬰幼兒血管瘤病例；d 右腹部嬰幼兒血管瘤病例；e 左額部嬰幼兒血管瘤病例。2、原代細(xì)胞培養(yǎng)

1-2 嬰幼兒血管瘤原代培養(yǎng)照片。a 嬰幼兒血管瘤組織培養(yǎng) 7 天，低倍鏡下可見組織塊周細(xì)胞爬出；b 嬰幼兒血管瘤組織培養(yǎng) 10 天，組織塊周圍有較多細(xì)胞爬出；c 將組織塊細(xì)胞收集并更換培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；d 細(xì)胞收集培養(yǎng)后 1 周，可見細(xì)胞基本長滿。二）細(xì)胞分選純化酒精擦拭及紫外燈消毒磁珠分選器，按照使用要求配置細(xì)胞懸液及磁珠懸液個 2ml 無菌 EP 管備用。按照使用流程分選細(xì)胞。

嬰幼兒血管瘤原代培養(yǎng)照片。a 嬰幼兒血管瘤組織培養(yǎng) 7 天，低倍鏡下可見組織塊胞爬出；b 嬰幼兒血管瘤組織培養(yǎng) 10 天，組織塊周圍有較多細(xì)胞爬出；c 將組織細(xì)胞收集并更換培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；d 細(xì)胞收集培養(yǎng)后 1 周，可見細(xì)胞基本長滿。）細(xì)胞分選純化精擦拭及紫外燈消毒磁珠分選器，按照使用要求配置細(xì)胞懸液及磁珠懸 2ml 無菌 EP 管備用。按照使用流程分選細(xì)胞。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2843007