目的:體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)誘發(fā)機體全身炎癥反應(systemic inflammatory response,SIRS),中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)是人體對抗感染與異己物質的第一道防線,在機體防御機制中起著關鍵性的作用。炎癥條件下,PMN大量激活,滲出后沉積于組織,造成周圍組織損傷。凋亡是PMN從炎癥部位非炎性清除的有效方式。因此,有效的治療CPB-SIRS可以從適時適量的誘導PMN凋亡入手。但是,目前對CPB后凋亡的變化的研究較少,機制尚未清楚。本研究通過動態(tài)觀察室間隔缺損修補術患兒在體外循環(huán)各時點靜脈血中PMN的凋亡率,及其Fas、Bcl-2凋亡調控蛋白表達的變化規(guī)律,探討CPB后PMN凋亡的變化及其分子生物學機制,為臨床從PMN凋亡調控入手防治CPB引發(fā)的全身炎癥反應提供實驗室依據。 方法:選擇擇期在體外循環(huán)下行室間隔缺損修補術的患兒30例(男13,女17),年齡1～5歲,體重10～20kg,術前NYHA心功能分級均在Ⅰ～Ⅱ級,采用大劑量芬太尼和低濃度異氟醚全身麻醉,維庫溴銨維持肌松。 體外循環(huán)前應用3mg/kg肝素抗凝,全身肝素化后根據全血激活凝血時間(ACT)酌情追加,維持ACT480s。CPB采用Sarns 8000型心肺機、兒童型膜式氧合器(國產希健-Ⅰ)、兒童型體外循環(huán)管道(科威)和兒童型動脈微栓過濾器(科威)進行體外轉流。根據術前血常規(guī)檢查結果,確定預充液的種類和容量,多采用6%羥乙基淀粉(賀斯)、復方乳酸鈉林格氏液以及壓積紅細胞預充,并在CPB中使Hct維持在25%～30%,鼻咽溫27～31℃,灌流量按2.2～2.8L·min-1·m-2體表面積計算,灌注壓力維持在50~80mmHg。 心肌保護采用冷晶體停跳液進行主動脈根部灌注。轉流中根據血氣分析結果調節(jié)電解質。在撤離體外循環(huán)前,患兒鼻咽溫度升至36℃。停CPB后,按1:1~2的劑量用硫酸魚精蛋白中和肝素。術中均不用激素、抑肽酶、全血及超濾。分別于麻醉誘導后CPB前(T0),CPB后30分鐘(T1),停CPB后30分鐘(T2),術后24小時(T3)共4個時點采取靜脈血標本,采用Ficoll液密度梯度離心法分離中性粒細胞,瑞氏染色檢驗分離的細胞純度,臺盼蘭檢驗細胞活性。將PMN用70%酒精固定18h后,用含0.1%Triton-X100和RNaseA酶的碘化丙啶(PI)避光染色,用流式細胞儀觀察PMN凋亡率(AP%)。另外取各時點100μl全血加入藻紅蛋白(PE)標記的Fas熒光單克隆抗體,溶血素裂解紅細胞的干擾,同時用鼠抗人PE標記IgG2aκ作同型陰性對照,用流式細胞儀檢測陽性細胞百分數。檢測Bcl-2的表達時,將分離的PMN懸于含10%胎小牛血清的1640培養(yǎng)液中,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時,破膜后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Bcl-2熒光單克隆抗體,同時用鼠抗人FITC標記IgG2aκ作同型陰性對照,流式細胞儀檢測陽性細胞百分數。 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件,計量資料采用均數±標準差(x±s)表示。不同時點的數據進行重復測量數據的方差分析,兩變量間的相互關系用直線相關分析。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結果: 1體外循環(huán)轉流持續(xù)時間52±17分鐘,阻斷升主動脈時間28±11分鐘。所有病例均痊愈出院。 2中性粒細胞凋亡率在CPB期間明顯降低,與T0比較,在T2時點達最低值(1.79±0.57%),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),T3時點恢復到CPB前水平(P0.05)。PMN凋亡率最低值與CPB持續(xù)時間呈負相關(r=-0.648,P0.05)。 3與T0比較,PMN膜上Fas的陽性表達細胞百分數在T2、T3時點降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與T2比較,T3時點數值開始上升,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Fas的陽性表達細胞百分數與PMN凋亡率最低值呈正相關(r=0.546,P0.05)。 4與T0比較,在T1、T2、T3時點PMN胞內Bcl-2的陽性表達細胞百分數升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Bcl-2陽性表達細胞百分數與PMN凋亡率最低值呈負相關(r=-0.569,P0.05)。 結論: 1. CPB觸發(fā)全身炎癥反應的過程中可導致中性粒細胞生存環(huán)境發(fā)生變化,產生的多種凋亡抑制因素使PMN凋亡受到抑制,從而PMN生存周期延長,PMN數目增加。 2. Fas蛋白是一種細胞凋亡信號受體,CPB后的中性粒細胞凋亡延遲與Fas蛋白的表達下調有關。 3. Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的一種抑凋亡蛋白,我們的研究顯示CPB后的中性粒細胞凋亡延遲與Bcl-2蛋白的表達上調有關。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R726.1
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞
研究論文 體外循環(huán)下室間隔缺損修補術對小兒中性粒細胞凋亡及其調控蛋白的影響
    前言
    材料與方法
    結果
    附表
    附圖
    討論
    結論
    參考文獻
綜述
致謝
個人簡歷

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