背景與目的: 腎母細(xì)胞瘤(Wilmstumor:nephroblastoma,WT)是一種小兒腎臟惡性腫瘤,占小兒所有實(shí)體腫瘤的8%左右,是兒童最常見的實(shí)體腫瘤之一。Max Wilms1899年曾對(duì)該瘤的特征進(jìn)行詳細(xì)的描述,故又命名為Wilms'瘤。本病多見于7歲以內(nèi)的兒童。本病的預(yù)后與腫瘤的組織學(xué)類型、發(fā)病年齡及是否轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),但對(duì)其預(yù)后影響最大的是腫瘤的局部侵犯和向重要臟器的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況。近40年來(lái)由于手術(shù)、化療及放療等措施的綜合應(yīng)用,腎母細(xì)胞瘤的死亡率大大降低,但是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后仍然較差。利用分子生物學(xué)手段尋找與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的基因,探索腫瘤預(yù)后標(biāo)志物成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。 CXCR4是近年來(lái)分離出的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,已有研究證明該基因的過(guò)度表達(dá)與多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,而SDF-1作為其配體,二者的結(jié)合在腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附、增殖、侵襲、抗凋亡、血管新生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。VEGF是作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一,在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF表達(dá)在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn),轉(zhuǎn)移和預(yù)后亦起著非常重要的作用。 本研究運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤組織和瘤旁正常組織中的CXCR4mRNA的表達(dá),并運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)CXCR4,SDF-1和VEGF蛋白的表達(dá)情況。分析三者與腎母細(xì)胞瘤臨床病理指標(biāo)的關(guān)系,并探討三指標(biāo)之間的相關(guān)性,旨在尋找可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和判斷腫瘤預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo),為腎母細(xì)胞瘤的臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇、組織樣本的采集和患者臨床資料的整理選取2007年-2008年間鄭大三附院,鄭大一附院,手術(shù)切除的腎母細(xì)胞瘤30例(其中新鮮標(biāo)本19例蠟塊11例)和瘤旁組織12例(距腫瘤大于5CM)分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,搜集患者的性別,臨床分期,病理類型,有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面的臨床資料,便于統(tǒng)計(jì)分析和研究。 2.采用Trizol試劑提取腎母細(xì)胞瘤組織RNA。通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳及RNA的OD值評(píng)估RNA的含量和純度。 3.使用Promega公司的AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR擴(kuò)增β-actin的檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效果。 4.設(shè)計(jì)兩者引物,對(duì)CXCR4基因在腎母細(xì)胞瘤及瘤旁正常組織中表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),CXCR4的相對(duì)含量=(CXCR4密度/β-actin密度)。 5.免疫組化方法檢測(cè)CXCR4、SDF-1和VEGF三種蛋白的表達(dá)情況。陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)著色,按染色強(qiáng)度分別進(jìn)行計(jì)分。計(jì)算機(jī)輔助圖像分析求其光密度(OD)值平均值,代表其蛋白的含量。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用χ~2檢驗(yàn),Fisher精確檢驗(yàn)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.RT-PCR結(jié)果顯示腫瘤組織中CXCR4mRNA的相對(duì)含量高于瘤旁組織(P＜0.05)。CXCR4mRNA相對(duì)含量在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期Ⅲ-Ⅳ組高于Ⅰ-Ⅱ期組,預(yù)后不良組CXCR4mRNA相對(duì)含量高于預(yù)后良好組。免疫組化檢測(cè)CXCR4蛋白結(jié)果和PCR結(jié)果吻合,呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)。 2.腎母細(xì)胞瘤中SDF-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率是53.3%(16/30),高于瘤旁腎組織(P＜0.05)。SDF-1蛋白光密度值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期Ⅲ-Ⅳ組顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組,預(yù)后不良組高于預(yù)后良好組(P＜0.05)。 3.腎母細(xì)胞瘤中VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率是63.3%(19/30),高于瘤旁組織(P＜0.05)。VEGF蛋白光密度值在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)組高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期Ⅲ-Ⅳ組高于Ⅰ-Ⅱ期組,預(yù)后不良組高于預(yù)后良好組(P＜0.05)。 4.相關(guān)性分析CXCR4與VEGF、SDF-1呈正相關(guān)(r=0.439,0.427 P＜0.05),SDF-1與VEGF呈正相關(guān)(r=0.369 P＜0.05)。 結(jié)論 1.RT-PCR技術(shù)與免疫組化技術(shù)檢測(cè)腎母細(xì)胞瘤組織CXCR4在mRNA和蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果表明其轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平具有一致性。 2.腎母細(xì)胞瘤中CXCR4、SDF-1和VEGF表達(dá)較對(duì)照組增高,并與NTWS分期、病理分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。 3.CXCR4、SDF-1和VEGF表達(dá)有相關(guān)性,CXCR4、VEGF和SDF-1的高表達(dá)提示腫瘤具有更高的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 4.對(duì)腎母細(xì)胞瘤中CXCR4、VEGF和SDF-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),可以判斷其惡性行為,預(yù)測(cè)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的潛能,為臨床治療提供理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R737.11
【部分圖文】：

圖1腎母細(xì)胞瘤RNA瓊脂糖凝膠電泳lQualitativeanalysisofRNAfraglnentsbyagarosegelele錄ega公司的A娜逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，每次均以滅菌的錄步驟:品70℃水浴smin，短暫離心Zmin后置于冰上。應(yīng)體系，加入上述PCR管中0xbuffer取lN仰s(10mM)取laseinhibior0.知landomprimer0.和lMVenzyme0.印l

圖5.SDF一l在腎母細(xì)胞瘤的表達(dá)(PV法IOx40)圖6.SDF一1在對(duì)照組的表達(dá)(PV法10x40)20O0bp1000bp750bp50Obp53lbP285bP250bp100bpMarker月中鄉(xiāng)富至目.又寸只硯建且

圖5.SDF一l在腎母細(xì)胞瘤的表達(dá)(PV法IOx40)圖6.SDF一1在對(duì)照組的表達(dá)(PV法10x40)20O0bp1000bp750bp50Obp53lbP285bP250bp100bpMarker月中鄉(xiāng)富至目.又寸只硯建且

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2830136