目的探討人巨細(xì)胞病毒在與心肌細(xì)胞損害之間的關(guān)系,為臨床病毒性心肌炎病原學(xué)研究和診斷提供理論依據(jù)。方法本實(shí)驗(yàn)分體外及體內(nèi)兩部分:(一)體外部分:第一部分是SD大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)。取出生1-3天的SD大鼠15只,無菌取其心室肌用0.25%胰蛋白酶消化后制成心肌單細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。第二部分是用HCMV病毒感染新生的SD大鼠的培養(yǎng)心肌細(xì)胞。取長(zhǎng)成單層的乳鼠心肌細(xì)胞,分成二組:○1細(xì)胞對(duì)照組○2病毒感染組。在病毒感染組細(xì)胞中每孔加0.5ml含100TCID50HCMV的生長(zhǎng)液,對(duì)照組僅加入等量的生長(zhǎng)液。37℃溫育2h后,各組棄上清液,加生長(zhǎng)液1ml/孔,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待病毒對(duì)照組CPE(++++)時(shí),停止培養(yǎng),觀察感染后的細(xì)胞病變、搏動(dòng)情況,取各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清,檢測(cè)培養(yǎng)液中心肌谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)乳酸脫氫酶(LDH),肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌鈣蛋白(cTnI)水平的改變并通過形態(tài)學(xué)鑒定HCMV在心肌細(xì)胞內(nèi)感染狀況。(二)體內(nèi)部分:以HCMV誘導(dǎo)BALB/C小鼠心肌炎模型。將30只小鼠分為A、B、C三組,每組10只。其中A組為HCMV感染組,腹腔注射HCMV AD169株懸液0.5ml/只;B組為HF對(duì)照組,腹腔注射HF懸液0.5ml/只;C組為DMEM對(duì)照組,腹腔注射DMEM懸液0.5ml/只。分別與注射后第20天取血、心肌標(biāo)本,進(jìn)行心肌病毒分離及病理和電鏡檢測(cè)。結(jié)果體外部分:培養(yǎng)的SD新生乳鼠心肌細(xì)胞感染HCMV后,細(xì)胞逐步出現(xiàn)病變,細(xì)胞停止搏動(dòng),在第5天及第7天的培養(yǎng)液中AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI均明顯高于細(xì)胞對(duì)照組(p0.05),同時(shí)HCMV pp65蛋白免疫熒光及免疫組化等檢測(cè)亦為陽性。體內(nèi)部分:HCMV感染小鼠心肌炎總發(fā)病率為80.0%,感染組分別在病毒感染后的第5～10天各死亡一只,死亡率為20.0%。HCMV感染后的第5-20天,病理HE染色可見心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變性、血管周圍可見有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),電鏡下心肌細(xì)胞內(nèi)可見有巨細(xì)胞病毒顆粒。結(jié)論1、HCMV AD169株使體外心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及酶學(xué)發(fā)生了改變,體內(nèi)心肌細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),說明HCMV可能具有感染鼠心肌細(xì)胞的能力。2、HCMV可能是病毒性心肌炎的重要病原體之一。在臨床治療小兒病毒性心肌炎時(shí),應(yīng)結(jié)合病原學(xué)檢測(cè),考慮針對(duì)HCMV的抗病毒治療。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R725.4
【部分圖文】：

16圖 1 正常乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)（×400）將 HCMV AD169 株細(xì)胞懸液接種在心肌細(xì)胞后的 2-3 天內(nèi),細(xì)胞搏動(dòng)變慢且不規(guī)則,CPE 不明顯；在接種后的第 4 天，心肌細(xì)胞搏動(dòng)明顯減少，部分細(xì)胞已完全停止搏動(dòng)。細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大量的空泡，折光性減弱,部分細(xì)胞出現(xiàn)了團(tuán)縮，如圖 2 所示

圖 2 HCMV 感染乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)（×400）3.1.2 HCMV 病毒的感染力（TCID50）實(shí)驗(yàn)時(shí)將保存病毒株傳一代后，培養(yǎng)瓶迅速凍融 3 次，離心去細(xì)胞碎片。滴定后實(shí)驗(yàn)結(jié)果：按 Read-Much 公式計(jì)算 TCID50為 10-4.7。3..1.3 心肌酶及心肌 cTnI 的測(cè)定如表 1 所示，在心肌細(xì)胞感染 HCMV 后的第 3 天時(shí)，AST、CK、CK-MB及 cTnI 與正常對(duì)照組相比無顯著性差異（p>0.05）,而在第 5 天及第 7 天時(shí) AST、LDH、CK、CK-MB 及 cTnI 均明顯高于正常對(duì)照組（p<0.05）。說明在感染 HCMV5天后心肌細(xì)胞已出現(xiàn)了損傷，且隨著感染的延伸其心肌酶有逐漸升高趨勢(shì)。

3.1.4 HCMV 感染心肌細(xì)胞免疫熒光結(jié)果用 HCMV pp65 單克隆抗體對(duì) HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，我們可見有蘋果綠色熒光陽性信號(hào)位于被感染的心肌細(xì)胞的胞核中。如圖 3 所示。陰性對(duì)照未見任何陽性信號(hào)。3.1.5 HCMV 感染心肌細(xì)胞表達(dá)早期蛋白用鼠抗人巨細(xì)胞病毒（CMV-EA）單克隆抗體與 HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞作用，在倒置顯微鏡下觀察，可見有紅褐色的陽性信號(hào)位于被感染的心肌細(xì)胞的胞核中。如圖 4 所示。

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2 楊s

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