【摘要】：【目的】 模擬新生兒出生窒息,建立新生大鼠缺氧模型,研究缺氧對(duì)新生鼠腦神經(jīng)源性分化因子(NeuroD)表達(dá)以及細(xì)胞凋亡和神經(jīng)再生影響,為新生兒圍產(chǎn)期窒息所致的缺血缺氧性腦病的防治研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】 1.將參照Grojean的方法,新生大鼠短暫置于100%氮?dú)猸h(huán)境中,建立出生窒息的模型。采用神經(jīng)行為學(xué)觀察、HE染色及透射電鏡觀察腦組織病理變化等方法,對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 2.動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組、缺氧10min組、缺氧20min組,采用冰凍切片的免疫熒光、Western blot檢測(cè)NeuroD表達(dá)量的變化。 3.動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組、缺氧20min組,一亞組分13d、20d、27d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材,采用冰凍切片的免疫熒光檢測(cè)NeuroD、石蠟切片的免疫組化檢測(cè)BrdU表達(dá)的變化。另一亞組分6d、20d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 【結(jié)果】 1.缺氧過程新生大鼠均出現(xiàn)全身紫紺、意識(shí)障礙等神經(jīng)行為的異常。HE染色可見缺氧10min海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹,缺氧20min神經(jīng)細(xì)胞的損傷加重。超微結(jié)構(gòu)顯示缺氧10min出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡早期表現(xiàn):核染色質(zhì)邊集,次級(jí)溶酶體形成。微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞發(fā)生空泡變性。缺氧20min后可見神經(jīng)元壞死,核溶解,細(xì)胞器模糊不清。微血管周圍星膠細(xì)胞腳板、細(xì)胞突起均腫脹。 2.免疫熒光結(jié)果顯示,在大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬齒狀回可見NeuroD表達(dá),Western blot分析也同樣顯示隨缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)NeuroD的表達(dá)量明顯增加(P0.01)。 3.免疫熒光/組化結(jié)果顯示,缺氧20min組13d、27d NeuroD/BrdU在海馬CA1區(qū)/SVZ的表達(dá)量均高于對(duì)照組(P㩳0.05),且在20d表達(dá)量最高(P㩳0.01)。TUNEL法檢測(cè)出缺氧20min后6d在海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P㩳0.01),而20d凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率與對(duì)照組比較無明顯差異。 【結(jié)論】 1.通過將新生大鼠短暫置于100%氮?dú)猸h(huán)境中的方法,可建立與人類新生兒缺血缺氧性腦損傷相似的新生大鼠出生窒息HIE模型。 2.短暫缺氧可引起NeuroD表達(dá)量的增加,表達(dá)部位主要在大腦皮質(zhì)、海馬、SVZ等神經(jīng)干/前體細(xì)胞聚集區(qū)。 3.缺氧導(dǎo)致遲發(fā)性凋亡的神經(jīng)元缺失,可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、神經(jīng)元分化,觸發(fā)神經(jīng)發(fā)生,對(duì)受損的腦組織進(jìn)行代償性修復(fù)和神經(jīng)功能的重建。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R722.12
【圖文】：

11圖1 缺氧模型Fig.1 Hypoxia model3 神經(jīng)行為觀察觀察正常對(duì)照組、缺氧10min組、缺氧20min組每只大鼠是否有夾尾尖叫、翻身能力異常，并記錄是否出現(xiàn)肢體抖動(dòng)、驚厥、意識(shí)障礙，出現(xiàn)上述一項(xiàng)以上異常作為神經(jīng)行為異常的標(biāo)準(zhǔn)。4 組織病理學(xué)觀察造模后即取正常對(duì)照組、缺氧10min組、缺氧20min組大鼠腦組織，制備石蠟切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)的腦組織病理變化。4.1 石蠟切片標(biāo)本的制備4.1.1 取材和固定新生SD大鼠乙醚吸入麻醉后，快速斷頭取出腦組織投入4%多聚甲醛溶液中固定，3h后冠狀切修塊，繼續(xù)固定48h，流水沖洗后置于70%乙醇中

活動(dòng)逐漸減少，夾尾尖叫聲減弱，翻身能力降低或消失，部分有肢體抽動(dòng)、驚厥及昏睡、昏迷等意識(shí)障礙。恢復(fù)正常供氧后膚色逐漸紅潤(rùn)，活動(dòng)增加，神經(jīng)行為異常消失。正常對(duì)照組未發(fā)生神經(jīng)行為異常（圖2）。圖 2 對(duì)照組與缺氧組Fig.2 Control group and hypoxia group

2 光鏡觀察對(duì)照組：海馬 CA1 區(qū)錐體細(xì)胞層次清晰，細(xì)胞排列緊密，分布均勻，大小一致，輪廓正常（圖 3B）。缺氧 10min 組：海馬 CA1 區(qū)錐體細(xì)胞排列較紊亂，部分細(xì)胞腫脹（圖 3C）。缺氧 20min 組：海馬 CA1 區(qū)錐體細(xì)胞層次減少，結(jié)構(gòu)松散，排列紊亂，細(xì)胞腫脹、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞與周圍間隙增寬（圖 3D）。

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本文編號(hào)：2798988