發(fā)布時(shí)間：2020-08-15 07:56

【摘要】：第一部分 1型糖尿病患兒NK細(xì)胞受體及其配體基因的初步研究 目的及意義：目前已知自然殺傷(nature kill, NK)細(xì)胞在1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用,殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(the killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)是NK細(xì)胞受體中極為重要的一類受體。某些KIR激活性基因和抑制性基因,可以單獨(dú)的或聯(lián)合它們的HLA-C配體,影響T1D的發(fā)生。本研究擬通過(guò)發(fā)現(xiàn)與T1D發(fā)病的相關(guān)基因型,研究KIR在T1D中的作用,進(jìn)一步闡明T1D的發(fā)病機(jī)理,為NK細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)并提供新的策略和方式。 方法：本文在中國(guó)漢族人群中,采用T1D和對(duì)照組年齡、性別一對(duì)一匹配對(duì)照,研究KIR基因及其配體HLA-C基因與1型糖尿病發(fā)病的相互關(guān)系。選取明確診斷的1型糖尿病患者259例,平均發(fā)病年齡6.94±3.64歲,其中男性123名,女性136名,所有患者均是漢族。所有患者均符合2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn),并除外2型糖尿病、特殊類型糖尿病等其他類型糖尿病。收集T1D患者性別、發(fā)病年齡、糖化血紅蛋白、C肽、是否合并糖尿病酮癥酸中毒、是否合并自身免疫性疾病,自身抗體檢測(cè)結(jié)果等臨床資料。在T1D組中,谷氨酸脫羧酶65片段(glutamic acid decarboxylase 65, GAD65)抗體資料齊全者128例,其中79例陽(yáng)性。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, IA2)抗體資料齊全者88例,其中59例陽(yáng)性。 選取正常對(duì)照262例,也均為漢族,與T1D患者組為年齡、性別一對(duì)一匹配對(duì)照。所有對(duì)照組成員進(jìn)行健康體檢,無(wú)糖尿病、肝腎疾病、自身免疫性疾病等慢性疾病史,與T1D組無(wú)血緣關(guān)系。 采取以上患者和對(duì)照者血樣,行KIR基因及其相應(yīng)配體HLA-C基因檢測(cè)。 結(jié)果：在1型糖尿病和正常對(duì)照中,KIR的基因型在兩組中沒(méi)有明顯的差異。但在1型糖尿病組中,HLA-C1基因和HLA-C2基因(邊緣相關(guān))發(fā)生的頻率較高。組合基因型2DL2-/HLA-C1+、2DL3+/HLA-C1+和2DS2-/HLAC1+與1型糖尿病呈正性相關(guān)。組合基因型2DL1+/HLA-C2-、2DL2-/HLA-C1-、2DL3+/HLA-C1-和2DS2-/HLAC1-與1型糖尿病呈負(fù)性相關(guān)。在我們檢測(cè)的基因中,HLA-C1和C2的組合與1型糖尿病有非常明顯的相關(guān)性,比HLA-C1單獨(dú)出現(xiàn)的相關(guān)性更強(qiáng)。在GAD抗體陽(yáng)性患者中,KIRs 2DL1、2DL2和2DL3以及HLA-C1的頻率較高；在IA-2抗體陽(yáng)性的患者中,KIRs 2DS4出現(xiàn)的頻率較高。但KIR/HLA-C和抗體的相關(guān)性經(jīng)Bonferroni校正后,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論：在我們的研究中,1型糖尿病與KIR基因型無(wú)直接的相關(guān)性,但是在1型糖尿病中KIR基因型與不同的HLA-C1和C2組合卻顯示出明顯的差異,各種KIR基因及其配體HLA-C的類型與1型糖尿病之間有不同的正性或負(fù)性的相關(guān)性。提示1型糖尿病的發(fā)生可能與KIR及其HLA-C失衡有關(guān)。 第二部分 A20轉(zhuǎn)基因抑制胰島移植排斥反應(yīng)作用的初步探討 目的及意義：通過(guò)在體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng),從根本上治愈糖尿病已逐漸成為共識(shí)。胰島移植是在體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)最安全、有效的方法之一。異種胰島移植可提供更豐富的供體胰島來(lái)源,但同時(shí)面臨的重大問(wèn)題就是免疫排斥反應(yīng)。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,基因治療技術(shù)的出現(xiàn)為最終解決移植免疫排斥問(wèn)題提供了可能性。由于A20具有抑制TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和抑制NF-κB活性的雙重功能,本研究通過(guò)攜帶A20基因的重組慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠胰島細(xì)胞,并植入糖尿病大鼠腎包膜下,建立鼠類異種胰島移植模型。研究A20基因在抑制鼠類異種胰島移植排斥反應(yīng)和保護(hù)胰腺β細(xì)胞免受細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡中的作用,為基因轉(zhuǎn)染胰島細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：分離培養(yǎng)胰島細(xì)胞采用膠原酶消化法,消化分離C57BL/6J小鼠的胰腺組織,用“兩次過(guò)篩法”純化出胰島細(xì)胞。純化的胰島細(xì)胞懸浮于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)28h后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染人A20慢病毒(lenti-A20)重組質(zhì)粒。用AO/PI熒光染色法鑒定胰島細(xì)胞的活性,雙硫腙(dithizone, DTZ)染色法鑒定純化胰島的純度。同時(shí),用腹腔一次注射STZ給藥的方法建立糖尿病SD大鼠模型,然后建立鼠類異種基因胰島細(xì)胞移植模型(C57BL/6J小鼠→患病的SD大鼠),以腎包膜下注射的方法實(shí)施胰島移植,分別將已制備的A20基因修飾的胰島細(xì)胞、未經(jīng)處理的胰島細(xì)胞和PBS移植給T1D大鼠,監(jiān)測(cè)移植后受體鼠血糖的濃度變化,同時(shí)測(cè)定胰島素分泌情況。在第3d取胰島細(xì)胞移植后受體鼠腎臟做免疫組化染色檢查。 結(jié)果：采用膠原酶灌注和兩次過(guò)篩獲得的胰島純度為90-100%,分離純化后的胰島細(xì)胞活率95%。胰島細(xì)胞具有良好的形態(tài),在倒置顯微鏡下呈圓形或卵圓形,大小不一,散在分布或成簇。基因轉(zhuǎn)染后胰島細(xì)胞的形態(tài)及活性無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比,A20基因修飾的胰島細(xì)胞移植組鼠在移植后糖尿病癥狀緩解；血糖水平于移植后第2天開(kāi)始下降至正常水平,并持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；胰島移植物存活時(shí)間(6±3d)較對(duì)照組(3±1d)有明顯延長(zhǎng)(P0.05)。移植后測(cè)定胰島素水平,數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染A20基因胰島細(xì)胞的移植組受體鼠的胰島素分泌水平升高,說(shuō)明該胰島細(xì)胞因成功誘導(dǎo)受體鼠的免疫耐受而得以存活。而無(wú)A20移植組受體鼠的胰島素水平下降較早,說(shuō)明移植胰島已被免疫排斥而破壞。 結(jié)論：A20基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能顯著延長(zhǎng)移植胰島的存活期,明顯改善受體鼠糖尿病癥狀,有效控制血糖水平,為改善1型糖尿病的胰島移植治療效果提供了新的途徑。A20基因抑制免疫排斥反應(yīng)和抗p細(xì)胞凋亡的雙重功效使之在胰島細(xì)胞移植,尤其是異種胰島移植領(lǐng)域中,將發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R725.8
【圖文】：

在移植后第3d和移植失敗后行受體腎臟免疫組織化學(xué)染色檢查。在腎被膜下可觀察到:移植后3d血糖正常時(shí)，可以找到胰島細(xì)胞團(tuán);而當(dāng)移植失敗，血糖明顯升高時(shí)，未能找到胰島細(xì)胞(圖3)。圖3腎被膜下胰島細(xì)胞移植術(shù)后的免疫組織化學(xué)染色A:移植后3d血糖正常時(shí)，仍可找到胰島細(xì)胞團(tuán)B:移植失敗，血糖明顯升高時(shí)，未見(jiàn)胰島細(xì)胞

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本文編號(hào)：2793833