【摘要】：第一部分 1型糖尿病患兒NK細胞受體及其配體基因的初步研究 目的及意義：目前已知自然殺傷(nature kill, NK)細胞在1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)的發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用,殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(the killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)是NK細胞受體中極為重要的一類受體。某些KIR激活性基因和抑制性基因,可以單獨的或聯(lián)合它們的HLA-C配體,影響T1D的發(fā)生。本研究擬通過發(fā)現(xiàn)與T1D發(fā)病的相關(guān)基因型,研究KIR在T1D中的作用,進一步闡明T1D的發(fā)病機理,為NK細胞在臨床上的應用奠定理論基礎并提供新的策略和方式。 方法：本文在中國漢族人群中,采用T1D和對照組年齡、性別一對一匹配對照,研究KIR基因及其配體HLA-C基因與1型糖尿病發(fā)病的相互關(guān)系。選取明確診斷的1型糖尿病患者259例,平均發(fā)病年齡6.94±3.64歲,其中男性123名,女性136名,所有患者均是漢族。所有患者均符合2010年美國糖尿病協(xié)會糖尿病診斷標準,并除外2型糖尿病、特殊類型糖尿病等其他類型糖尿病。收集T1D患者性別、發(fā)病年齡、糖化血紅蛋白、C肽、是否合并糖尿病酮癥酸中毒、是否合并自身免疫性疾病,自身抗體檢測結(jié)果等臨床資料。在T1D組中,谷氨酸脫羧酶65片段(glutamic acid decarboxylase 65, GAD65)抗體資料齊全者128例,其中79例陽性。蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, IA2)抗體資料齊全者88例,其中59例陽性。 選取正常對照262例,也均為漢族,與T1D患者組為年齡、性別一對一匹配對照。所有對照組成員進行健康體檢,無糖尿病、肝腎疾病、自身免疫性疾病等慢性疾病史,與T1D組無血緣關(guān)系。 采取以上患者和對照者血樣,行KIR基因及其相應配體HLA-C基因檢測。 結(jié)果：在1型糖尿病和正常對照中,KIR的基因型在兩組中沒有明顯的差異。但在1型糖尿病組中,HLA-C1基因和HLA-C2基因(邊緣相關(guān))發(fā)生的頻率較高。組合基因型2DL2-/HLA-C1+、2DL3+/HLA-C1+和2DS2-/HLAC1+與1型糖尿病呈正性相關(guān)。組合基因型2DL1+/HLA-C2-、2DL2-/HLA-C1-、2DL3+/HLA-C1-和2DS2-/HLAC1-與1型糖尿病呈負性相關(guān)。在我們檢測的基因中,HLA-C1和C2的組合與1型糖尿病有非常明顯的相關(guān)性,比HLA-C1單獨出現(xiàn)的相關(guān)性更強。在GAD抗體陽性患者中,KIRs 2DL1、2DL2和2DL3以及HLA-C1的頻率較高；在IA-2抗體陽性的患者中,KIRs 2DS4出現(xiàn)的頻率較高。但KIR/HLA-C和抗體的相關(guān)性經(jīng)Bonferroni校正后,無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論：在我們的研究中,1型糖尿病與KIR基因型無直接的相關(guān)性,但是在1型糖尿病中KIR基因型與不同的HLA-C1和C2組合卻顯示出明顯的差異,各種KIR基因及其配體HLA-C的類型與1型糖尿病之間有不同的正性或負性的相關(guān)性。提示1型糖尿病的發(fā)生可能與KIR及其HLA-C失衡有關(guān)。 第二部分 A20轉(zhuǎn)基因抑制胰島移植排斥反應作用的初步探討 目的及意義：通過在體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng),從根本上治愈糖尿病已逐漸成為共識。胰島移植是在體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)最安全、有效的方法之一。異種胰島移植可提供更豐富的供體胰島來源,但同時面臨的重大問題就是免疫排斥反應。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,基因治療技術(shù)的出現(xiàn)為最終解決移植免疫排斥問題提供了可能性。由于A20具有抑制TNF誘導的細胞凋亡和抑制NF-κB活性的雙重功能,本研究通過攜帶A20基因的重組慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠胰島細胞,并植入糖尿病大鼠腎包膜下,建立鼠類異種胰島移植模型。研究A20基因在抑制鼠類異種胰島移植排斥反應和保護胰腺β細胞免受細胞因子誘導的凋亡中的作用,為基因轉(zhuǎn)染胰島細胞移植的臨床應用奠定基礎。 方法：分離培養(yǎng)胰島細胞采用膠原酶消化法,消化分離C57BL/6J小鼠的胰腺組織,用“兩次過篩法”純化出胰島細胞。純化的胰島細胞懸浮于含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)28h后的細胞轉(zhuǎn)染人A20慢病毒(lenti-A20)重組質(zhì)粒。用AO/PI熒光染色法鑒定胰島細胞的活性,雙硫腙(dithizone, DTZ)染色法鑒定純化胰島的純度。同時,用腹腔一次注射STZ給藥的方法建立糖尿病SD大鼠模型,然后建立鼠類異種基因胰島細胞移植模型(C57BL/6J小鼠→患病的SD大鼠),以腎包膜下注射的方法實施胰島移植,分別將已制備的A20基因修飾的胰島細胞、未經(jīng)處理的胰島細胞和PBS移植給T1D大鼠,監(jiān)測移植后受體鼠血糖的濃度變化,同時測定胰島素分泌情況。在第3d取胰島細胞移植后受體鼠腎臟做免疫組化染色檢查。 結(jié)果：采用膠原酶灌注和兩次過篩獲得的胰島純度為90-100%,分離純化后的胰島細胞活率95%。胰島細胞具有良好的形態(tài),在倒置顯微鏡下呈圓形或卵圓形,大小不一,散在分布或成簇。基因轉(zhuǎn)染后胰島細胞的形態(tài)及活性無明顯變化。與對照組相比,A20基因修飾的胰島細胞移植組鼠在移植后糖尿病癥狀緩解；血糖水平于移植后第2天開始下降至正常水平,并持續(xù)時間較長；胰島移植物存活時間(6±3d)較對照組(3±1d)有明顯延長(P0.05)。移植后測定胰島素水平,數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染A20基因胰島細胞的移植組受體鼠的胰島素分泌水平升高,說明該胰島細胞因成功誘導受體鼠的免疫耐受而得以存活。而無A20移植組受體鼠的胰島素水平下降較早,說明移植胰島已被免疫排斥而破壞。 結(jié)論：A20基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能顯著延長移植胰島的存活期,明顯改善受體鼠糖尿病癥狀,有效控制血糖水平,為改善1型糖尿病的胰島移植治療效果提供了新的途徑。A20基因抑制免疫排斥反應和抗p細胞凋亡的雙重功效使之在胰島細胞移植,尤其是異種胰島移植領域中,將發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R725.8
【圖文】：

在移植后第3d和移植失敗后行受體腎臟免疫組織化學染色檢查。在腎被膜下可觀察到:移植后3d血糖正常時，可以找到胰島細胞團;而當移植失敗，血糖明顯升高時，未能找到胰島細胞(圖3)。圖3腎被膜下胰島細胞移植術(shù)后的免疫組織化學染色A:移植后3d血糖正常時，仍可找到胰島細胞團B:移植失敗，血糖明顯升高時，未見胰島細胞

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