發(fā)布時間：2020-08-10 07:22

【摘要】： 第一部分兒童HBV-MN腎組織細(xì)胞凋亡的研究 目的觀察兒童乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎病(hepatitis B virus-associated membranous nephropathy, HBV-MN)腎組織的細(xì)胞凋亡情況,以探討其在HBV-MN發(fā)病中的意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測19例HBV-MN及5例正常腎組織caspase-3的表達(dá),取細(xì)胞核呈棕黃色者為活性caspase-3陽性細(xì)胞,計(jì)數(shù)平均單個腎小球內(nèi)陽性細(xì)胞比例及平均單位面積內(nèi)腎小管-間質(zhì)區(qū)陽性細(xì)胞個數(shù),分別計(jì)為腎小球凋亡指數(shù)和腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù),并分析其與腎組織病理改變、尿蛋白、及臨床免疫學(xué)指標(biāo)等因素的關(guān)系。同時對其中15例患兒行TUNEL檢測,取細(xì)胞核呈棕黃色者為TUNEL陽性細(xì)胞,以前述方法計(jì)算腎小球及腎小管-間質(zhì)區(qū)的TUNEL指數(shù),并分析其與凋亡指數(shù)(由活性caspase-3所得)的相關(guān)性。采用免疫組織化學(xué)方法檢測14例HBV-MN及3例正常腎組織HBx的表達(dá)。結(jié)果①正常腎組織,caspase-3僅見于少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞胞漿,未見腎小球內(nèi)表達(dá)；在HBV-MN患兒腎組織,均存在caspase-3的腎小球內(nèi)表達(dá),并且大多見于足細(xì)胞胞核區(qū),而在腎小管-間質(zhì)區(qū)caspase-3不僅見于腎小管上皮細(xì)胞胞漿,尚可見于胞核區(qū),且表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組；以TUNEL分析對活性caspase-3染色進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)腎小球和腎小管-間質(zhì)區(qū)的凋亡指數(shù)與TUNEL指數(shù)均顯著相關(guān)(r=0.812, P=0.0496 r=0.958, P=0.0026);②HBV-MN患兒腎組織活性caspase-3的表達(dá)與腎臟病變病理分期顯著相關(guān),Ⅲ-Ⅳ期患兒的腎小球凋亡指數(shù)及腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)均明顯高于Ⅰ-Ⅱ期(P=0.015,0.049)；但腎小球凋亡指數(shù)與HBsAg的沉積強(qiáng)度無顯著相關(guān)性；③HBV-MN患兒腎小球內(nèi)活性Caspase-3的表達(dá)與臨床蛋白尿水平相關(guān),24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的腎小球凋亡指數(shù)明顯高于小于50mg/kg者(P=0.034),但與血清補(bǔ)體C3水平無顯著相關(guān)性；④HBV-MN患兒腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)與蛋白尿水平顯著相關(guān),24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于小于50mg/kg者(P=0.0046)；且與尿RBP水平相關(guān),尿RBP升高組的活性caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于尿RBP正常組(P=0.0012)。⑤71%HBV-GN患兒的腎小球內(nèi)存在不同程度的HBx表達(dá),其主要分布于腎小球毛細(xì)血管襻及足細(xì)胞胞漿。結(jié)論HBV-MN患兒腎小球及腎小管-間質(zhì)區(qū)均存在依賴caspase-3的腎臟固有細(xì)胞凋亡,活性caspase-3的表達(dá)與腎臟病變嚴(yán)重程度、臨床蛋白尿水平及尿RBP水平相關(guān)。腎臟固有細(xì)胞凋亡可能在HBV-MN的病理過程中發(fā)揮重要作用,而HBx蛋白可能與足細(xì)胞凋亡及進(jìn)而的缺失密切相關(guān)。 第二部分?jǐn)y帶HBx基因重組腺病毒載體制備及其對足細(xì)胞凋亡的影響 目的臨床病理研究部分提示凋亡是HBV-MN患兒腎小球足細(xì)胞缺失的主要原因之一。而HBV-GN通常發(fā)生于HBV慢性感染患者,在此病理過程中HBV-DNA可與宿主DNA隨機(jī)整合并發(fā)生基因重排,編碼HBx等反式激活因子,進(jìn)而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞增殖或凋亡。因此,本部分研究旨在通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBx基因?qū)胱慵?xì)胞株,研究HBx對足細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)。方法由質(zhì)粒PCI-neo-HBx中擴(kuò)增目的基因HBx,插入至pShuttle-CMV(-)穿梭質(zhì)粒中,而后再與pAdxsi質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接為重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx,經(jīng)酶切及測序鑒定正確后,以PacⅠ酶切線性化轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝擴(kuò)增得到Ad. HBx。以CsCl密度梯度離心法純化病毒,TCID50法檢測病毒滴度。以瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)。Annexin V-PI雙染方法檢測足細(xì)胞凋亡。結(jié)果①重組腺病毒載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、電泳和基因測序鑒定,證實(shí)Ad. HBx構(gòu)建成功；②細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示,腺病毒感染后24h,Ad. HBx組細(xì)胞的核分裂相明顯增多甚至出現(xiàn)病理性核分裂相,巨核、雙核、多核細(xì)胞的比例也較Ad組明顯增加,但兩組間的細(xì)胞凋亡率無明顯差異；腺病毒感染后48h,Ad. HBx組細(xì)胞除上述有絲分裂障礙的病變更加明顯外,胞體縮小、胞核濃染固縮的凋亡細(xì)胞比例較Ad組明顯增多；③Annexin V-PI雙染法顯示,于腺病毒感染后24h,空白對照組、Ad組和Ad. HBx組三組間的凋亡細(xì)胞比例無明顯差異；而于感染后48h,Ad. HBx組細(xì)胞的凋亡率較空白對照組和Ad組均明顯升高(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建了Ad. HBx為進(jìn)一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)。外源性HBx表達(dá)可直接誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。HBx可能是致HBV-GN患兒足細(xì)胞缺失的主要病因之一,在HBV-GN的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。 第三部分外源性HBx表達(dá)抑制小鼠足細(xì)胞增殖 目的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎(hepatitis B virus-associated nephritis, HBV-GN)是一種以足細(xì)胞病變?yōu)樘卣鞯募膊�。HBV-GN患兒腎活檢組織中足細(xì)胞數(shù)目均存在不同程度減少,而增殖受限是足細(xì)胞缺失的主要機(jī)制之一。本研究通過構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBV X基因(即HBx基因)導(dǎo)入足細(xì)胞株,探討HBx蛋白對足細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。方法采用pAdxsi系統(tǒng)構(gòu)建攜帶HBx基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體；以瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)；以MTT檢測和CFDA SE熒光染料示蹤細(xì)胞增殖的方法,對細(xì)胞增殖進(jìn)行定量評估；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布；采用cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和Western-blot檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。結(jié)果PCR和基因測序鑒定,證實(shí)Ad. HBx構(gòu)建成功。Western blot顯示,足細(xì)胞感染Ad.HBx(MOI=100)后第3、5天均可表達(dá)分子量為17kD的HBx蛋白,表明HBx可在足細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示腺病毒感染后第5天Ad.HBx組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的有絲分裂障礙特征,雙核、多核和多形核細(xì)胞比例明顯增加。MTT檢測結(jié)果顯示空白組和Ad組足細(xì)胞的生長曲線基本吻合,而Ad.HBx組細(xì)胞的生長曲線自第4天起較前兩組偏低,至第5天時該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時,CFSE細(xì)胞增殖示蹤實(shí)驗(yàn)也證實(shí),于腺病毒感染后第3天Ad. HBx組細(xì)胞的增殖速度(增殖指數(shù)11.15)已明顯低于空白組和Ad組(增殖指數(shù)15.4和13.3),且隨時間推移進(jìn)一步減慢(增殖指數(shù)32.5vs.61.65,53.96),表明HBx可顯著抑制足細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白檢測的結(jié)果顯示,HBx可誘導(dǎo)足細(xì)胞周期G2/M阻滯,同時伴有cyclin B1、p21的表達(dá)上調(diào)及cyclin A的下調(diào)。結(jié)論本部分研究顯示,乙肝病毒基因編碼的HBx蛋白可使cyclin B1降解受阻,同時下調(diào)cyclin A和上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)蛋白p21的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,從而抑制足細(xì)胞增殖。這可能是HBV-GN患者腎小球足細(xì)胞缺失,腎臟病變慢性進(jìn)展的重要機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R726.9
【圖文】：

華中科技大學(xué)博士學(xué)位_.業(yè)止叁(5.72士4.35%)，且多數(shù)為足細(xì)胞，以及所有患兒的腎小管一間質(zhì)區(qū)(158.45士1犯.61可mmZ)，見圖1一ZC&1一ZD。腎小球和腎小管一間質(zhì)區(qū)的凋亡指數(shù)與TUNEL指數(shù)均顯著相關(guān)(;=0.812，P=0.0496&r=0.958，P=0.0026)。在正常腎組織，腎小球內(nèi)未見caspase一3表達(dá)(圖1一ZE)，其僅表達(dá)于少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞胞漿(圖1一ZF);TIJNEL陽性信號也僅偶見于個別腎小管上皮細(xì)胞。

華中科技大學(xué)博士學(xué)位_.業(yè)止叁(5.72士4.35%)，且多數(shù)為足細(xì)胞，以及所有患兒的腎小管一間質(zhì)區(qū)(158.45士1犯.61可mmZ)，見圖1一ZC&1一ZD。腎小球和腎小管一間質(zhì)區(qū)的凋亡指數(shù)與TUNEL指數(shù)均顯著相關(guān)(;=0.812，P=0.0496&r=0.958，P=0.0026)。在正常腎組織，腎小球內(nèi)未見caspase一3表達(dá)(圖1一ZE)，其僅表達(dá)于少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞胞漿(圖1一ZF);TIJNEL陽性信號也僅偶見于個別腎小管上皮細(xì)胞。

1.2.3活性casPase一3的表達(dá)與HBv-MN患兒腎組織病理改變的關(guān)系(表1一l):腎組織病理改變重(111一W期)的HBV-MN患兒腎小球凋亡指數(shù)及腎小管一間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)均明顯高于病變輕者(I一11期)，14.85士5.07%vs7.76士2.51%和534.24士165.51/nunZvs303.15士133.56/mmZ(p=0.015&0.049)。但HBsAg的沉積強(qiáng)度與活性caspase一3陽性細(xì)胞數(shù)無顯著相關(guān)性(p>0.05)。，~，，悶.門.巨.‘~‘.~.22

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 林婷;細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎中表達(dá)及其意義[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號：2787762