【摘要】：目的:BPD是早產(chǎn)兒嚴重的肺部并發(fā)癥,早產(chǎn)兒的體重、胎齡越低,發(fā)病率越高。BPD不僅是超低出生體重早產(chǎn)兒早期死亡的主要原因,也是1歲以內(nèi)頻繁再入院的主要原因,更是生長不足及遠期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良的獨立危險因素,嚴重影響新生兒今后的生活質(zhì)量。因此,探索其發(fā)病機制,尋求有效的預(yù)防措施和治療手段,成為目前亟待解決的問題之一。AECⅡ是肺泡上皮細胞的干細胞,是肺損傷時最易受損的細胞,受損后其增殖分化過程均出現(xiàn)障礙,是肺發(fā)育過程中肺泡化障礙的重要因素。AECⅡ的異常轉(zhuǎn)分化,即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是肺泡化障礙的重要機制之一,研究AECⅡ上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制,如何能夠抑制或逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,具有重要意義。BMP7是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員之一,具有廣泛的生物學(xué)功能,可調(diào)節(jié)多種細胞的分化、增殖和凋亡。研究顯示BMP7可抑制和逆轉(zhuǎn)上皮細胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細胞。近年來發(fā)現(xiàn)BMP7在肺組織的病理生理過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。本人的前期研究發(fā)現(xiàn)BMP7在BPD新生鼠肺組織中存在差異表達。為了證實BPD中AECⅡ是否也存在BMP7的表達異常,異常表達的BMP7是否活化了下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad,我們對新生鼠BPD模型組和對照組肺組織原代提取的AECⅡ進行BMP7及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad1,smad2/3的檢測;為了證實BMP7可能通過調(diào)控smad2/3蛋白磷酸化調(diào)節(jié)肺泡上皮細胞EMT參與到BPD的發(fā)生、發(fā)展,我們應(yīng)用美國ATCC公司的大鼠肺上皮細胞RLE-6TN細胞系,通過外源性BMP7進行干預(yù),觀察細胞生物學(xué)功能、轉(zhuǎn)分化指標及BMP7下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad1,smad2/3的變化;為了能夠更好地調(diào)節(jié)BMP7表達以避免或減少EMT的發(fā)生,結(jié)合本課題組前期通過基因芯片技術(shù)對BPD模型大鼠標本進行micoRNA篩選,我們篩選出差異表達的micoRNA,通過生物信息學(xué)預(yù)測差異miRNA能否靶向結(jié)合BMP7,并通過擴大樣本量驗證差異表達miRNA,過;在證實BMP7在BPD中表達豐度逐漸減低,miR-365-3p在BPD中表達豐度逐漸增高的基礎(chǔ)上,應(yīng)用大鼠肺泡上皮細胞系,利用雙熒光素酶報告基因證明二者之間的結(jié)合關(guān)系,利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù),觀察EMT相關(guān)標志物、BMP7和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad的變化,明確miR-365-3p靶向下調(diào)BMP7表達調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程。為miR-365-3p作為未來BPD治療的特定靶標提供證據(jù)。研究方法:按照我們課題組以往的方法建立新生鼠BPD模型。將自然分娩的200只新生SD大鼠隨機分到BPD組和對照組。BPD組新生鼠吸入80%的氧氣,對照組新生鼠吸入空氣,于實驗后的3、7、14天,分別隨機選取10只新生大鼠分離肺組織。行HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué),按照我們課題組以往的方法進行原代AECⅡ的提取、純化培養(yǎng)和鑒定。純化的AECⅡ細胞應(yīng)用細胞免疫熒光定位BMP7、smad1、smad2/3蛋白的表達,Western blot測定AECⅡ細胞中BMP7、smad2/3、p-smad2/3蛋白的表達,qRT-PCR測定AECⅡ細胞中BMP7、smad1、smad2、smad3 mRNA的表達。從液氮中取出凍存的RLE-6TN細胞進行復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代,將生長良好的細胞進行消化,接種于6孔板中,細胞按照不同的處理因素分為4組:control組:正常RLE-6TN單層細胞。BMP7組:用10ng/ml的BMP7作用RLE-6TN單層細胞。EGF組:用20ng/ml的EGF作用RLE-6TN單層細胞。BMP7+EGF組:分別加入10ng/ml的BMP7和20ng/ml的EGF共同作用RLE-6TN單層。48小時收集細胞。于光鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化,細胞劃痕實驗觀察細胞水平遷移情況,免疫熒光雙染定位RLE-6TN細胞中E-cad/N-cad、Spb/vimentin的蛋白表達,免疫細胞化學(xué)染色定位RLE-6TN細胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad1、smad2/3的蛋白表達,Western blot測定RLE-6TN細胞中E-cad、N-cad、vimentin、smad1、p-smad1、smad2/3、p-smad2/3蛋白的表達,qRT-PCR測定RLE-6TN細胞中E-cad、N-cad、vimentin、smad1、smad2、smad3 mRNA的表達。通過TargetScan生物學(xué)信息預(yù)測網(wǎng)站,結(jié)合課題組前期采用基因芯片檢測獲得的結(jié)果,篩選出差異表達的micoRNA。行miRNAs qRT-PCR測定BPD肺組織和AECⅡ中miR-365-3p的表達。RLE-6TN細胞轉(zhuǎn)染過表達miR-365-3p,行miRNAs qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。于光鏡下觀察轉(zhuǎn)染miR-365-3p mimics后RLE-6NT細胞的形態(tài)學(xué)觀察變化。Western blot測定轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后間質(zhì)標志物N-cad和上皮標志物E-cad蛋白表達。qRT-PCR測定轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后間質(zhì)標志物N-cad和上皮標志物E-cad mRNA的表達。Western blot測定轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后BMP7、smad2/3、p-smad2/3蛋白表達變化。qRT-PCR測定轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后BMP7、smad2、smad3 mRNA表達變化。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因驗證miR-365-3p與BMP7的結(jié)合。結(jié)果:1、肺組織形態(tài)學(xué)觀察可見隨時間延長,BPD組肺泡數(shù)量減少,次級分隔減少,RAC值降低,提示出現(xiàn)肺泡發(fā)育停滯。免疫熒光結(jié)果顯示BPD組BMP7表達明顯高于對照組,細胞胞漿和胞核均可見。隨日齡增加BMP7熒光強度逐漸減弱,14dBPD組胞核中基本看不到BMP7紅色熒光。對照組基本恒定表達BMP7,并且表達主要定位于胞漿。Western blot顯示實驗第3天和第7天,BPD組BMP7蛋白表達較對照組增高,隨日齡增加BPD組BMP7蛋白表達逐漸減低趨勢。qRT-PCR顯示BPD組中BMP7 mRNA表達較對照組明顯增高,但呈現(xiàn)隨日齡增加BMP7 mRNA表達逐漸減低趨勢。2、免疫熒光結(jié)果顯示smad1綠色熒光主要定位在細胞胞漿,胞核未見綠色熒光表達。smad2/3表達BPD組高于對照組,綠色熒光主要定位在細胞胞漿和胞核。7天BPD組smad2/3增高最明顯,并且綠色熒光均定位在細胞胞核,胞質(zhì)中僅有少量綠色熒光。14天BPD組smad2/3表達下降,綠色熒光主要集中在胞漿。略低于對照組的熒光強度。BPD組組間smad2/3的表達經(jīng)歷了在胞核表達先增多后減少的過程。Western blot顯示BPD組組間呈現(xiàn)隨日齡增加p-smad2/3蛋白表達明顯增高然后減低趨勢。smad2/3總蛋白表達逐漸減低趨勢。qRT-PCR顯示BPD組smad1mRNA表達呈現(xiàn)先減低后增高的變化,BPD組中smad2 mRNA表達較對照組明顯增高,BPD組組間呈現(xiàn)隨日齡增加smad2 mRNA表達逐漸增加趨勢,smad3 mRNA的變化趨勢同smad2。3、倒置相差顯微鏡下可見BMP7組細胞仍維持上皮樣形態(tài),細胞與細胞之間連接較緊密。EGF組細胞之間連接松散,間隙變大并有明顯的絲狀偽足形成,呈現(xiàn)出成纖維細胞樣。而BMP7+EGF組細胞間細胞連接較EGF組緊密,絲狀偽足減少。BMP7組不影響細胞的遷移能力,EGF組可導(dǎo)致細胞遷移能力增加,BMP7+EGF組細胞的遷移能力減低,一定程度抑制了細胞的遷移。免疫熒光雙染定位可見EGF組E-cad表達較弱,N-cad表達較強;BMP7+EGF組E-cad明顯增多,N-cad明顯減少。EGF組Spb表達較弱,Vimentin表達較強;BMP7+EGF組Spb明顯增多,Vimentin明顯減少。Western blot顯示control組和BMP7組N-cad和Vimentin均較EGF組表達量低,BMP7+EGF組較EGF組表達量低,但高于control組和BMP7組。control組和BMP7組E-cad表達量較EGF組增高,BMP7+EGF組較EGF組表達量高,但低于control組和BMP7組。qRT-PCR顯示control組和BMP7組N-cad和Vimentin mRNA均較EGF組表達量低,BMP7+EGF組較EGF組表達量低。control組和BMP7組E-cad表達量較EGF組增高,BMP7+EGF組較EGF組表達量高,但低于control組和BMP7組。4、免疫細胞化學(xué)染色顯示control組少量表達smad1蛋白,BMP7組、EGF組和BMP7+EGF組均未使smad1蛋白表達有明顯增高,且定位主要在細胞胞漿,胞核僅見量少smad1表達。免疫細胞化學(xué)染色顯示BMP7組和BMP7+EGF組均可見大量的smad2/3蛋白定位于細胞核,細胞核與細胞質(zhì)均可見染成棕黃色的顆粒。control組和EGF組少量表達smad2/3蛋白,且smad2/3蛋白主要表達于細胞胞漿。Western blot顯示BMP7組、EGF組和BMP7+EGF組smad1總蛋白的表達較control組均有不同程度下降。和control組相比,p-smad1蛋白在BMP7組表達略有升高,在EGF組和BMP7+EGF組的表達均有不同程度下降。smad2/3總蛋白在control組和BMP7組的表達基本一致,在EGF組的表達較control組明顯下降,在BMP7+EGF組表達較EGF組有所升高。p-smad2/3蛋白在BMP7組表達明顯升高,EGF組和BMP7+EGF組較control組均有不同程度增高,BMP7+EGF組增高的更明顯。qRT-PCR顯示各處理組smad1 mRNA表達較control組均有所減少。和control組比較,BMP7組smad2 mRNA的表達明顯增高。EGF組smad2 mRNA的表達與control組無差異,BMP7組smad2 mRNA的表達和EGF組比較明顯增高。BMP7+EGF組的smad2 mRNA的表達較control組增多,但較BMP7組減低。smad3 mRNA的表達變化趨勢與smad2 mRNA基本一致。5、通過TargetScan生物學(xué)信息預(yù)測網(wǎng)站,結(jié)合課題組前期采用基因芯片檢測獲得的結(jié)果,篩選出24個差異表達的micoRNA,其中miR-365-3p與BMP7可能存在靶向結(jié)合位點。miRNAs qRT-PCR顯示在肺組織和AECⅡ中,miR-365-3p在BPD組中的表達水平高于同日齡對照組中的表達。通過miRNAs qRT-PCR驗證過表達miR-365-3p的效率,過表達效率顯著。轉(zhuǎn)染miR-365-3p后細胞形態(tài)學(xué)觀察可見control組和NC組細胞為上皮樣細胞形態(tài),細胞具有明顯的極性,細胞與細胞之間緊密連接,miR-365-3p組細胞之間連接松散,間隙變大并有明顯的絲狀偽足形成,呈現(xiàn)出成纖維細胞樣改變。Western blot顯示轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后,N-cad蛋白表達增高,E-cad蛋白表達下降。qRT-PCR顯示轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后,N-cad mRNA表達增高,E-cad mRNA表達下降。Western blot顯示轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后BMP7、p-smad2/3、smad2/3蛋白表達較對照組均下降。qRT-PCR顯示轉(zhuǎn)染miR365-3p mimics后BMP7、smad2、smad3 mRNA表達較對照組和NC組均下降。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染BMP7-wt和miR-365-3p mimics能引起293T工具細胞熒光素酶活性顯著下降,miR-365-3p能與BMP7的結(jié)合。結(jié)論:1、以往研究已證實在BPD肺組織中,BMP7表達增高,且隨時間延長逐漸下降。本研究發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型肺泡上皮細胞中,BMP7表達變化發(fā)生的時間與組織同步,并且其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad2/3出現(xiàn)轉(zhuǎn)運活化,表明該通路在BPD的發(fā)生中發(fā)揮作用。2、體外實驗證實,EGF誘導(dǎo)肺上皮細胞后,BMP7通過活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad2/3抑制肺泡上皮細胞轉(zhuǎn)分化,此發(fā)現(xiàn)為臨床應(yīng)用提供新途徑。3、分別在組織水平和細胞水平驗證miRNA-365-3p在BPD中高表達。miR-365-3p能夠靶向結(jié)合BMP7,下調(diào)BMP7及減少下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白smad2/3活化,是肺上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的重要機制,為未來BPD的防治提供新途徑。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R722.6
【圖文】：

圖 1.1 BPD 組與對照組肺組織形態(tài)學(xué)改變（200×）。（A）對照組第 3 天，肺泡間隔較薄，肺泡數(shù)目較少，肺泡大小均勻。（B）BPD 組第 3 天均可見肺泡間隔變厚。（C）對照組第 7 天，肺泡間隔變薄，肺泡大小均勻。（D）BPD 組第 7天可見肺泡數(shù)量變少，體積變大，形態(tài)不規(guī)則，肺泡間隔略厚，肺間質(zhì)水腫，肺泡腔內(nèi)可見炎性細胞浸潤。（E）對照組第 14 天，肺泡腔均勻，肺間隔棘突出現(xiàn)，肺間隔較薄，次級間隔數(shù)量明顯增多，肺泡數(shù)目增多。（F）BPD 組第 14 天，模型組肺泡腔明顯增大，肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡間隔厚，肺泡結(jié)構(gòu)簡單化。3.2 輻射狀肺泡計數(shù)（RAC）值測定RAC是反映肺泡發(fā)育程度的重要指標，用以代表肺泡的大小。對照組新生大鼠RAC隨日齡呈增加趨勢，與對照組比較，BPD組從7天開始下降，14天下降最明顯（P＜0.01）（圖1.2）。12

按照AECⅡ差速貼壁法對提取的肺組織進行分離、純化，培養(yǎng)及鑒定。光鏡下可見培養(yǎng)的細胞呈圓形、橢圓形或多邊形，細胞呈島狀生長，細胞胞漿內(nèi)有反差明顯的顆粒，符合AECⅡ的形態(tài)特征(圖1.3)。AECⅡ特異性標志物SPC免疫細胞化學(xué)染色可見細胞漿內(nèi)被染成棕黃色顆粒(圖1.4)，免疫熒光染色可見胞質(zhì)染成紅色的陽性細胞，陽性細胞占細胞總數(shù)的90%以上(圖1.5)。圖1.3 原代提取AECⅡ的形態(tài)學(xué)觀察（400×）。光鏡下見AECⅡ呈圓形、橢圓形或多邊形，細胞呈島狀生長，細胞胞漿內(nèi)有反差明顯的顆粒。圖1.4 AECⅡ特異性標志物SPC免疫細胞化學(xué)染色（400×）。AECⅡ特異性標志物SPC免疫細胞化學(xué)染色可見細胞漿內(nèi)被染成棕黃色顆粒的陽性細胞。

CⅡ的形態(tài)特征(圖1.3)。AECⅡ特異性標志染成棕黃色顆粒(圖1.4)，免疫熒光染色可細胞總數(shù)的90%以上(圖1.5)。1.3 原代提取AECⅡ的形態(tài)學(xué)觀察（400×）。圓形、橢圓形或多邊形，細胞呈島狀生長，細胞

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 常立文;;支氣管肺發(fā)育不良的治療現(xiàn)狀[J];中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志;2018年06期

2 黃秀芳;邵建永;顏黎栩;李曉霞;杜紫明;鄧玲;梁小曼;;乳腺癌差異表達的MicroRNA的篩選研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2009年01期

本文編號：2777044